一、番鸭的一种新病——“花肝病”（论文文献综述）
田昂[1]（2021）在《新型鸭呼肠孤病毒间接ELISA检测方法的建立及应用》文中认为近年来,我国出现了一种以鸭脾脏坏死为特征的传染病,病鸭精神沉郁,出现软脚症状。该病发病日龄较小,病情发展迅速,引起脾脏坏死从而导致免疫力下降,容易造成其他病原微生物的继发感染,因此死亡率较高。新型鸭呼肠孤病毒（Novel Duck Reovirus,NDRV）被认为是引起该病的病原。目前,确诊该病一般采用RT-PCR、荧光定量PCR等方法进行该病病原的快速检测,而间接酶联免疫吸附试验（Indirect Enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA）则可用于该病的大规模血清学调查。NDRV的σC蛋白是它的主要保护性抗原蛋白,本研究将原核表达的NDRVσC蛋白作为包被抗原,建立了检测NDRV血清抗体的iELISA方法,并对其进行了初步应用。本文研究内容分为以下两部分:第一部分:检测NDRV抗体iELISA方法的建立从脾脏坏死的鸭中分离得到一株NDRV,命名为SD19。设计引物,利用RT-PCR技术扩增编码σC蛋白的全基因,将扩增产物连接至p ET-32a（+）载体并在大肠杆菌BL21中表达。Western bolt分析后,将所表达的蛋白作为包被抗原建立检测鸭血清中NDRV抗体的iELISA方法。优化的最佳条件为:包被σC蛋白浓度5μg/m L 100μL/孔、包被时间4℃12h、37℃1.5h封闭、被检血清1:80稀释、血清孵育37℃1.5h、底物反应15min、临界值为0.34。用建立的iELISA检测方法对GPV、NGPV、MDPV、DHAV-1、DHAV-3的单因子血清及NDRV阴阳性血清进行检测,结果发现除NDRV阳性血清以外其他血清检测数值均小于0.34,说明建立的检测NDRV血清抗体的iELISA方法特异性高,确定的临界值是合适的。对100份鸭血清分别用iELISA和Dot blot方法进行检测,结果发现两者的结果符合率为93%,说明建立的iELISA检测方法用来进行NDRV抗体的血清学调查是可行的。第二部分:运用建立的iELISA检测方法进行血清学调查运用建立的iELISA检测方法对来自山东和江苏两省20个场的1000份1-40日龄樱桃谷肉鸭血清进行NDRV抗体检测,结果表明,NRDV群阳性率为100%（20/20）,个体阳性率为53.3%（533/1000）;其中山东肉鸭个体阳性率为54%（270/500）,江苏肉鸭个体阳性率为52.6%（263/500）。1-10日龄、10-20日龄、20-30日龄和30-40日龄肉鸭个体阳性率分别为58%（145/250）、55%（165/300）、50.5%（101/200）和48.8%（122/250）。运用iELISA方法对来自山东和江苏两省10个场的500份14-61周龄父母代樱桃谷种母鸭的血清进行检测,结果表明,NRDV群阳性率为100%（10/10）,个体阳性率为60%（300/500）;其中山东父母代种母鸭个体阳性率为65.2%（163/250）,江苏父母代种母鸭个体阳性率为54.8%（137/250）。14-25周龄、26-35周龄、36-45周龄、46-61周龄父母代种母鸭个体阳性率分别为61%（122/200）、53%（53/100）、65%（65/100）、60%（60/100）。对江苏省某个祖代种鸭场种公鸭的检出阳性率为96%（48/50）。以上对樱桃谷鸭祖代种公鸭、父母代种母鸭和商品代肉鸭进行的血清学检测表明,NDRV在山东、江苏两省的鸭群中已普遍存在,对其感染必须引起高度重视。
周五朵[2]（2014）在《不同致病力MDRV双重RT-PCR检测方法建立及诱导细胞凋亡研究》文中研究表明番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）是以感染番鸭出现“肝白点”为主要病变特征,并可引起软脚,喜卧,趾、跗关节肿胀等症状的一种传染性很强的病毒。2001年以来,本实验室分离出多株番鸭呼肠孤病毒,其中包括不同致病力的YB株和YJL株。经测序分析,YB株与MDRV法国89026株的S4基因同源性达94%以上,而YJL株与禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）S1133株、176株的S1基因之间同源率高达96%以上,YB株与YJL株之间S组基因同源性低于30%。YB毒株在临床上表现为高致病力的特点,能够引起高的致死率,YJL毒株,在临床上对番鸭表现为低致病力的特点。由于两毒株在临床症状上有着类似发病症状和致病机理,通过临床诊断鉴别比较困难,所以建立一种快速、高效、特异的检测方法对于临床上区分不同致病力毒株具有重要意义。YJL株的S1基因编码P10、P17和σ C三个蛋白,而YB株的S4基因编码P10和σC两个蛋白,不含有P17蛋白,且两个毒株的P10蛋白基因的同源性极低。根据这2株病毒基因特点,分别针对YB株P10蛋白基因和YJL株P17蛋白基因设计2对特异性引物,通过条件优化成功建立了可鉴别这2个毒株的双重RT-PCR。结果显示:该方法可同时扩增出YB288 bp、YJL441 bp长度的特异性片段,而对其他番鸭病病原无扩增结果;该方法最佳反应条件为95℃预变性5 min,94 ℃1 min,55℃ 45 s,72℃ 1 min,30 个循环,72℃延伸 10 min;该方法最低能检出10 pg YB和YJL株RNA模板;使用单重PCR和多重PCR方法对60份临床疑似病料检测验证,两者符合率为100%。结果表明该方法特异性、敏感性和重复性良好,具有快速、准确的特点,可用于这2种不同致病力毒株的鉴别。针对临床上番鸭群存在不同致病力毒株感染情况,为该病的防治增加了难度,因此对其致病机理的阐明显得尤其重要。在病毒感染的过程中,对宿主免疫器官和嗜性器官有致凋亡的作用,本研究用2株病毒（YB株与YJL株）对宿主、原代鸭胚成纤维细胞（Muscovy duck embryo fibroblasts,MDEF）感染,探讨2株病毒诱导细胞凋亡的情况。实验首先测定两毒株的TCID50,用MTS法测定病毒感染后12h、24h、36h、48h、72h、96h共6个时间段的MDEF细胞活力,根据细胞活力出现的拐点时间用荧光显微镜、DNA Ladder提取、流式细胞仪检测三种方法,对病毒诱导的细胞凋亡情况进行了定性和定量检测;最后用Western Bloting检测宿主肝脏细胞、脾脏细胞以及MDEF细胞的（48h、72h）空白组、YB、YJL接毒组共12份细胞样品中的凋亡执行蛋白Caspase-3的活化水平。结果表明:YB毒株在MDEF细胞上的TCID50远高于YJL毒株,为其3倍。MTS活力检测出细胞接毒组活力拐点在48h,有大幅活力降低现象,YB组活力低于YJL组。荧光显微镜在48h可观察到YB和YJL组均能诱导细胞早期凋亡,YB比YJL株表现出更多的晚期凋亡。DNA ladder检测表明,两个毒株均表现出经典的Ladder特征,YB组比YJL组时间更早,Ladder更明显,空白组未出现。流式细胞仪检测结果表明,YB组诱导组织细胞凋亡的能力高于YJL组,YB组肝脏细胞凋亡水平远高达75%,脾脏为23%,症状明显期肝脏细胞凋亡集中于中晚期,脾脏细胞凋亡分布于各个时期;YJL组肝脏、脾脏水平相差不大,均在10%左右;检测MDEF细胞凋亡发现,48h的接毒组较空白组细胞凋亡水平明显增加,72h的YB组凋亡细胞主要处于中晚期,YJL组则在早、中晚期均有分布。Western Bloting检测凋亡执行蛋白Caspase-3的活化水平发现,空白组肝脏和脾脏未见活化的Caspase-3（17KD）蛋白表达;YB组肝脏、脾脏细胞活化的Caspase-3（17KD）有明显增量表达;YJL组肝脏和脾脏则有少量活化的Caspase-3（17KD）表达。MDEF空白细胞48h和72h Caspase-3蛋白没有明显活化,MDEF细胞72h的YB组Caspase-3蛋白活化水平较空白组明显增加;YJL组Caspase-3蛋白活化水平表达量较YB组明显低了很多,72h较48h活化水平增加。本研究对2株不同致病力毒株建立了一种快速高效的双重RT-PCR诊断方法,对实际生产、实验室诊断提供借鉴;并从细胞凋亡角度对两毒株的致病机理进行了研究,确定了两毒株的感染能力,以及两毒株致细胞发生病变的时间拐点和具体的凋亡水平和时间,为后续病毒蛋白功能和相关信号通路研究提供了基础数据;从对宿主肝、脾组织进行凋亡检测结果来看,病毒致细胞凋亡在病毒感染机体机制中扮演重要角色。
逯艳云[3]（2013）在《鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞凋亡的研究》文中认为本试验采用细胞培养术、RT-PCR技术、光镜、电镜、荧光定量RT-PCR、TUNEL和流式细胞术等多种研究方法,对近几年来湖北省鸭源呼肠孤病毒分离株（Duck Reovirus, DRV） JZ061214株、HP080421株、HP081122株、HP09318株和YM101120株感染BHK-21细胞后细胞的病理变化特点、基因结构特点、病毒增殖状况和诱导细胞凋亡情况等作了系统的研究。DRV感染BHK-21细胞的病理变化情况：攻毒后24h,细胞开始出现病变,表现为有的细胞圆缩,溶解、碎裂,攻毒48h后,病变逐渐加重,圆缩细胞越来越多,并可见悬浮的巨细胞,攻毒72h后,大量死亡细胞悬浮于培养液中。细胞经H.E染色,显微镜观察可见：部分细胞死亡,感染细胞核固缩、碎裂,且出现嗜酸性包涵体和合胞体。感染DRV的BHK-21被收集用来制作超薄切片,电镜下可观察到大小不一的空泡,同时,细胞质中呈现晶格状排列的病毒颗粒,病毒在细胞质增殖、复制,通过细胞崩解释放出来。DRV感染BHK-21后的增殖情况：于接种病毒后1-72h七个时间段分别进行收毒,用荧光定量RT-PCR法检测所获病毒含量。结果表明,HP080421株、YM101120株和JZ061214株于攻毒后1～12h病毒含量较低,且呈上升趋势；JZ061214株、HP080421株和HP09318株于攻毒后24-72h病毒含量亦呈上升趋势；4株DRV病毒含量均于攻毒后72h达到高峰。DRV感染BHK-21细胞后流式细胞仪检测细胞凋亡情况：HP09318和HP080421凋亡高峰出现在攻毒后3h,YM101120的凋亡高峰在攻毒后6h,而JZ061214出现在12h；它们的凋亡高峰时间有所不同,但均集中在攻毒后3-12h。且随着攻毒时间的延长,后期死亡细胞数呈增长趋势。DRV感染BHK-21细胞后TUNEL检测细胞凋亡结果：4株DRV均于攻毒后3h检测到了比对照组多的凋亡阳性细胞,这些细胞的核都被染成棕黄色,随着死亡细胞数的增加,凋亡的阳性细胞数递减。这一凋亡情况与流式细胞仪检测的结果基本一致。DRVS组基因扩增情况：对五株DRV S2、S3和S4基因进行扩增,分别扩增出1251bp、1104bp、1104bp的片段。测序结果通过进化树分析：五株分离株的S2基因与NP03和GZ/CHN/2007的遗传进化关系最近,分属同一分支,五株分离株的S3基因与GZ/CHN/2007遗传关系最近,分属同一分支,其中HP09318、HP081122、JZ061214、YM101120与HP080421属同一亚系；五株分离株的S4基因与GZ/CHN/2007遗传进化关系最近,分属同一进化分支；五株DRVS2基因之间的同源性高达98～100%,与DRV GZ/CHN/2007株同源性高达99%,与MDRV S12株同源性高达95%,与GRV03G株同源性高达97%,与所有ARV毒株的同源性都低,范围在77%～78%间；五株DRV S3基因之间的同源性为98-100%,与DRVNP03株同源性高达99%,与DRV091株同源性高达98%,与GZ/CHN/2007同源性高达97%,与MDRV03G株同源性高达95%,与ARV毒株的同源性也较低；五株DRV S4基因之间的同源性类似于S2基因的表现情况。
张大丙[4]（2012）在《当前鸭病流行现状及防控对策》文中研究表明近十年来,我国水禽业发展迅速,涌现了很多大型的养鸭企业。但是,大部分养鸭还处于设备简陋,饲养管理粗放的模式。鸭病的流行日趋复杂,具体表现为:老病仍在流行,新病陆续出现;有些疾病虽然流行较久,但其病原出现了新的血清型或变异株;某些过去认为鸭可感染但不发病的
严进[5]（2009）在《禽（番鸭）呼肠孤病毒TaqMan探针荧光RT-PCR诊断方法的建立及应用》文中认为番鸭呼肠孤病毒感染是近几年在中国福建、浙江、江苏、广东等中国南方番鸭饲养区出现的一种新的番鸭疫病,又称为番鸭肝白点病,俗称“肝白点病”或“花肝病”,是一种以软脚为临床特征的急性传染病。其发病率和死亡率较高,给番鸭养殖业造成了严重的经济损失。因此,建立一种切实可行且快速的诊断方法越来越受到国内外水禽养殖业的关注。本课题以本实验室分离鉴定保存的番鸭呼肠孤病毒YB分离株为研究材料,采用TaqMan探针法,建立了针对番鸭呼肠孤病毒的实时荧光RT-PCR诊断方法并进行了初步应用。本试验研究包括:1.对实时荧光RT-PCR诊断方法反应条件的优化用番鸭胚扩增病毒,提取病毒核酸,用该核酸对反应的条件进行优化。通过试验表明,退火/延伸温度用57℃,上游引物和下游引物终浓度都为0.7 uM,TaqMan探针的终浓度为0.5 uM时,可以获得较佳的CT值及Delta Rn值。2.标准品的制备及重复性试验将RT-PCR所得到的目的片段切胶回收后,将回收片断连接PMD18-T Vector,再将连接产物转化到DH5α感受态细胞,培养重组菌,然后提取重组质粒。该重组质粒可做为该诊断方法的标准阳性对照,且重组菌易于保存,重组质粒容易获得,这样比保存病毒更为方便。测出重组质粒的浓度及其拷贝数,将其稀释到1.0×1010,做为标准品保存。将该标准品10倍稀释后,选取3个浓度的标准品,每个浓度做4次重复试验验证该方法的稳定性,试验结果表明其变异系数较小,稳定性良好。3.标准曲线的构建将标准品10倍稀释后选取5个浓度梯度,每个梯度做4个重复,做出标准曲线。标准曲线的斜率（Slope）为-3.1,相关系数（R2）为0.994,该标准曲线的相关性较好。4.应用该诊断方法的灵敏度较高,至少能检测到100拷贝/uL的标准品,比普通的PCR灵敏度高100倍。通过对该方法的特异性试验表明,该诊断方法不受鸭其它常见病毒的干扰。通过人工攻毒雏番鸭,对其肝脏组织进行检测,检出率达到100 %。应用该诊断方法也能对临床采集的样品进行检测。
曾强,张济培,陈武活,陈建红[6]（2008）在《雏番鸭呼肠孤病毒病的防治试验》文中研究表明
黄梅清[7]（2006）在《禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗的制备和免疫效果的研究》文中进行了进一步梳理1997年以来，在我国南方番鸭养殖地区爆发一种新发疫病——禽（番鸭）呼肠孤病毒感染，俗称番鸭“肝白点病”或“花肝病”，发病率20％～90％，死亡率10％～30％，应激或混合感染时高达90％以上。由于该病潜伏期短（3～11天），易感日龄小（1～10日龄），雏番鸭免疫系统发育未成熟，难以产生足够的抗体抵挡病毒的攻击，所以获得足够的母源抗体是防控该病的重要手段。本研究以此为出发点，试制了禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗，用于免疫接种种番鸭以产生母源抗体保护雏番鸭抵抗病毒的感染，为制定免疫程序防控该病提供重要的依据。 制备疫苗的种毒来源于本实验室分离保存的禽（番鸭）呼肠孤病毒YB分离株，该病毒株具有良好的抗原性和免疫原性。用番鸭胚成纤维细胞传代培养，获得病变集中、一致、病毒含量较高(TCID50为10-7.1934／0.1ml)的细胞毒，即为疫苗抗原液。疫苗抗原液经0.3％甲醛溶液灭活后，用油乳佐剂乳化制成疫苗。 建立间接ELISA方法以检测禽（番鸭）呼肠孤病毒抗体滴度。经二次差速离心、盐析法浓缩提纯细胞毒，获得浓度为0.7355mg／ml病毒抗原液。制备了阳性血清（琼扩效价为1：16）、阴性血清、二抗（兔抗番鸭）阳性血清（琼扩效价为1：128），提纯二抗并标记HRP酶，获得合格的酶标二抗。建立了间接ELISA检测方法：抗原稀释30倍，酶标二抗稀释50倍，血清稀释50倍，临界值为0.5。结果判定：以能产生阳性反应的血清最高稀释度为该血清的终点抗体滴度。 制备的疫苗为油包水型乳白色油状物，稳定性较好。经检验安全，番鸭无不良反应。疫苗放置4℃冰箱保存3个月，免疫效力不变。用试制的疫苗于产前10天免疫种番鸭，皮下注射，1ml／只。免疫后14天，阳转率达100％，抗体水平持续上升，至免疫后60天，抗体滴度约保持在1：700，此后抗体水平开始下降。取种番鸭免疫20天后产下的种蛋，孵出雏番鸭。3日龄雏番鸭母源抗体水平平均达到1：200，7日龄时下降至1：70，14日龄时检测不到母源抗体。 当免疫种番鸭抗体效价达到高峰（抗体滴度1：900）后，取其后代雏番鸭作为免疫组番鸭进行保护力实验，未免疫种番鸭的后代雏番鸭则作为空白组。在进行雏番鸭保护力实验前，预先攻毒一批雏番鸭，待其发病后，把感染发病的番鸭与免疫组、空白组番鸭同群饲喂，检测母源抗体对雏番鸭的保护效果。结果表明：当饲养同居群中感染发病鸭数量达到13％时，有母源抗体的雏番鸭存活率为60％。当饲养同居群中感染发病鸭数量超过40％时，母源抗体无法保护雏番鸭不发病。当攻毒剂量≤5×104.1934TCID50／羽时，则有70％以上的保护。而无母源抗体的雏番鸭在受到≥103.1934TCID50／羽毒量攻击或者饲养同居群中感染发病鸭数量大于13％时，死亡率达到50％以上。 选取不同地区的2个种番鸭养殖场进行田间试验，全场免疫试制的禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗，随机采集种番鸭血清，测定抗体滴度，结果均达到实验预期水平，跟踪其后代雏番鸭的生长，饲养良好，未发生禽（番鸭）呼肠孤病毒感染。
郑腾,曹治云,张志灯[8]（2005）在《我国番鸭呼肠孤病毒病的研究现状》文中研究指明番鸭呼肠孤病毒病是我国近年来新出现的、以软脚为特征的高发病率、高致死率急性烈性病毒性传染病,由于肝脏表面的灰白点较为典型,因此俗称“花肝病”或“白点病”。初步认为其病原为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属番鸭呼肠孤病毒。本文综合了国内近年来对该病的研究成果,从病原学、流行病学、临诊症状、病理学、区别诊断和防制措施等方面对该病进行了较全面的论述,以期对该病的深入研究和防制提供有益的资料。
王林川,陈庆华,徐昌领,鄢志强,陈芳艳,王政,何辉,赵赣,王丙云,计慧琴,冯军,刘富来[9]（2004）在《番鸭花肝病(暂定名)病原的分类地位研究》文中研究说明本文对从广东、福建分离的番鸭花肝病（暂定名）病毒的7个分离株进行了细胞蚀斑纯化、部分生物学特性鉴定、人工发病、电镜观察、病毒核酸PCR/RT-PcR检测及部分核苷酸序列分析,确定我国的番鸭花肝病（暂定名）的病原有两类:一类为呼肠孤病毒感染,另一类为细小病毒感染,两类病原可单独引发疾病;其中后者是国内外对该病原的首次确认,并就番鸭花肝病（暂定名）病原的起源作了调查及探索。
黄爱芳,刘思伽[10]（2004）在《番鸭花肝病流行病学诊断与防制》文中进行了进一步梳理番鸭花肝病是一种新病 ,对番鸭养殖业造成了较大的经济损失 ,成为影响我国番鸭养殖业的一种重要疾病。近几年来学者们进行了大量的研究工作 ,在流行病学、病原鉴定和防治方面取得了一些突破。对进一步的研究和临床工作都具有参考价值
二、番鸭的一种新病——“花肝病”（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、番鸭的一种新病——“花肝病”（论文提纲范文）
（1）新型鸭呼肠孤病毒间接ELISA检测方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒的研究进展与国内外现状 |
| 1.2 病原学特征与分子生物学特性 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床特征 |
| 1.5 病理变化 |
| 1.6 致病机理 |
| 1.7 诊断与防治 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒及血清 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 菌株、质粒及抗生素 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 引物设计及序列分析 |
| 2.1.7 试剂及溶液的配制 |
| 2.7.1.1 琼脂糖凝胶及TAE电泳液的配制 |
| 2.1.7.2 LB培养基的配制及固体平板的制备 |
| 2.1.7.3 IPTG诱导剂的配制 |
| 2.1.7.4 氨苄青霉素溶液的配制及Ca Cl2 的配制 |
| 2.1.7.5 包涵体分离纯化试剂 |
| 2.1.7.6 Western Blot及 SDS-PAGE试剂配制 |
| 2.1.8 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒培养增殖 |
| 2.2.2 NDRV在 DF1 细胞上的增值及IFA(间接免疫荧光)实验 |
| 2.2.3 新型鸭呼肠孤病毒RNA的提取及反转录 |
| 2.2.4 新型鸭呼肠孤病毒σC片段的扩增 |
| 2.2.5 DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.6 PCR产物(σC片段)的回收与p MD18-T载体的连接 |
| 2.2.7 质粒的转化与阳性克隆的筛选 |
| 2.2.8 重组质粒DNA(pMD18-T-σC)的提取与酶切验证 |
| 2.2.9 测序 |
| 2.2.10 双酶切 |
| 2.2.11 连接 |
| 2.2.12 BL21(DE3)感受态细胞的制备 |
| 2.2.13 转化 |
| 2.2.14 重组表达载体的酶切鉴定 |
| 2.2.15 蛋白表达、提取及包涵体纯化 |
| 2.2.16 SDS-PAGE电泳及免疫印记Western-Blot |
| 2.2.17 iELISA检测方法的初步建立 |
| 2.2.17.1 最佳蛋白包被浓度的确立 |
| 2.2.17.2 最佳包被时间的确立 |
| 2.2.17.3 最佳封闭时间的确立 |
| 2.2.17.4 最佳血清稀释倍数的确立 |
| 2.2.17.5 最佳血清孵育时间的确立 |
| 2.2.17.6 底物最佳反应时间的确立 |
| 2.2.17.7 临界值的确定 |
| 2.2.17.8 特异性试验 |
| 2.2.18 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.19 iELISA检测方法的测评 |
| 2.2.20 血清学调查 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 NDRV在 DF1 细胞上的增殖及IFA |
| 3.2 RT-PCR的结果分析及测序分析 |
| 3.3 重组质粒pMD18-T-σC酶切验证 |
| 3.4 重组表达载体p ET32a(+) -σC酶切验证 |
| 3.5 SDS-PAGE电泳及免疫印记Western-Blot的结果分析 |
| 3.6 iELISA检测方法建立及条件优化结果分析 |
| 3.6.1 最佳蛋白包被浓度的确立 |
| 3.6.2 最佳包被时间的确立 |
| 3.6.3 最佳封闭时间的确立 |
| 3.6.4 最佳血清稀释倍数的确立 |
| 3.6.5 最佳血清孵育时间的确立 |
| 3.6.6 底物最佳反应时间的确立 |
| 3.6.7 临界值的确定 |
| 3.6.8 特异性试验 |
| 3.7 iELISA检测方法测评结果分析 |
| 3.8 血清学调查 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）不同致病力MDRV双重RT-PCR检测方法建立及诱导细胞凋亡研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 一 研究的目的和意义 |
| 二 研究现状综述 |
| 1.禽(番鸭)呼肠孤病毒的研究进展 |
| 1.1 呼肠孤病毒科背景介绍 |
| 1.2 禽呼肠孤病原历史 |
| 1.3 番鸭呼肠孤病原历史 |
| 1.4 禽(番鸭)呼肠孤病毒特性与结构特点 |
| 1.5 禽(番鸭)呼肠孤病毒基因组及其功能蛋白介绍 |
| 1.5.1 病毒基因组介绍 |
| 1.5.2 病毒蛋白组功能介绍 |
| 1.6 禽(番鸭)呼肠孤病毒致病情况及流行病学 |
| 2.禽(番鸭)呼肠孤病毒诊断方法的研究进展 |
| 2.1 PCR快速诊断 |
| 2.2 免疫荧光快速检测 |
| 2.3 ELISA鉴别诊断技术 |
| 2.4 反向乳胶凝集检测病原法 |
| 3.番鸭呼肠孤病毒诱导细胞凋亡的研究进展 |
| 三本研究的特色与问题 |
| 第二章 不同致病力MDRV双重RT-PCR检测方法立 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株、鹎胚 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 原代MDEF细胞的培养 |
| 1.2.2 MDRV-YB株和YJL株在鸭胚和细胞上的传代和培养 |
| 1.2.3 YB株P10基因和YJL株P17基因的引物设计 |
| 1.2.4 YB株和YJL株PCR模板的制备 |
| 1.2.5 YB株和YJL株单引物扩增和测序 |
| 1.2.6 双重RT-PCR反应条件和反应体系的优化 |
| 1.2.7 双重RT-PCR特异性试验 |
| 1.2.8 双重RT-PCR敏感性试验 |
| 1.2.9 双重RT-PCR重复性试验 |
| 1.2.10 临床样品的检测应用 |
| 2.实验结果与分析 |
| 2.1 YB株和YJL株单引物扩增及测序结果 |
| 2.2 双重RT-PCR反应条件及体系的优化结果 |
| 2.3 双重RT-PCR特异性试验 |
| 2.4 双重RT-PCR敏感性试验 |
| 2.5 双重RT-PCR重复性试验 |
| 2.6 临床样品的检测 |
| 3.讨论 |
| 第三章 不同致病力MDRV诱导细胞凋亡的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株、番鸭胚、番鸭 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 YB株和YJL株在MDEF细胞上的传代与扩增 |
| 1.2.2 YB株和YJL株在MDEF细胞上TCID_(50)的测定 |
| 1.2.3 显微镜观察YB株和YJL株在细胞上的病变 |
| 1.2.4 MTS法检测YB株和YJL株接种细胞的活力 |
| 1.2.5 不同致病力毒株诱导细胞凋亡的检测 |
| 1.2.5.1 荧光显微镜检测 |
| 1.2.5.2 DNA ladder法检测2毒株诱导细胞凋亡水平 |
| 1.2.5.3 流式细胞仪检测2毒株诱导细胞凋亡水平 |
| 1.2.6 Western Bloting检测Caspase-3蛋白活化水平 |
| 2.实验结果与分析 |
| 2.1 YB株和YJL株在MDEF细胞上的TCID_(50)测定结果 |
| 2.2 显微镜观察YB株和YJL株在MDEF细胞上的病变结果 |
| 2.3 MTS法对YB株和YJL株接种细胞的活力检测结果 |
| 2.4 不同致病力毒株诱导细胞凋亡的检测结果 |
| 2.4.1 荧光显微镜观察结果 |
| 2.4.2 DNA ladder法检测不同毒株诱导细胞凋亡水平结果 |
| 2.4.3 流式细胞仪检测不同毒株诱导细胞凋亡水平结果 |
| 2.5 Western blotting检测Caspase-3蛋白活化水平结果 |
| 3.讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1.第二章主要仪器设备 |
| 附录2.第三章主要仪器设备 |
| 附录3.第二、三章主要试剂 |
| 附录4.Western Bloting试剂配制和检测步骤 |
| 致谢 |
（3）鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1 禽呼肠孤病毒(ARV)病概述 |
| 1.1 呼肠孤病毒病 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.2.1 传染源 |
| 1.2.2 传播途径 |
| 1.2.3 易感动物 |
| 1.3 鸡呼肠孤病毒感染 |
| 1.4 鸭呼肠孤病毒感染 |
| 2 禽呼肠孤病毒 |
| 2.1 呼肠孤病毒的形态特点 |
| 2.2 病毒对细胞的致病性 |
| 2.3 病毒的基因组结构 |
| 3 呼肠孤病毒与细胞凋亡 |
| 本研究的目的与意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 参考序列 |
| 1.4 主要实验耗材 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 1.6 主要溶液及其配制 |
| 1.6.1 细胞生长(营养)液 |
| 1.6.2 细胞维持液 |
| 1.6.3 PBS(0.1M,pH=7.2,无钙镁)配制 |
| 1.6.4 4%中性多聚甲醛 |
| 1.6.5 50×TAE电泳缓冲液 |
| 1.6.6 琼脂糖凝胶 |
| 1.6.7 TBS(0.01M,pH=7.5)配法 |
| 1.6.8 2.5%戊二醛固定液配制 |
| 1.6.9 LB配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 BHK-21细胞的传代培养 |
| 2.2 鸭源呼肠孤病毒的接种和增殖 |
| 2.3 鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞的病变 |
| 2.4 TUNEL法染色检测细胞凋亡 |
| 2.5 鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞的超微病变及观察 |
| 2.6 实时荧光定量RT-PCR检测DRV感染后BHK-21细胞和其培养液混合物中的病毒含量 |
| 2.7 流式细胞仪对4株DRV攻毒后BHK-21细胞凋亡的检测 |
| 2.8 鸭源呼肠孤病毒S组基因的扩增 |
| 2.9 产物的回收和纯化 |
| 2.10 产物连接和转化 |
| 2.11 菌液PCR鉴定 |
| 2.12 序列分析 |
| 3 数据统计与处理 |
| 结果与分析 |
| 1 病毒致BHK-21细胞的病理变化观察 |
| 1.1 倒置显微镜下观察细胞的形态 |
| 1.2 光镜下观察细胞病变 |
| 1.3 鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞的超微病变 |
| 2 实时荧光定量RT-PCR检测DRV感染后BHK-21细胞和其培养液混合物中的病毒含量 |
| 3 BHK-21细胞感染DRV后,应用流式细胞仪进行细胞凋亡检测结果 |
| 4 BHK-21细胞感染DRV后,应用TUNEL进行细胞凋亡检测的结果 |
| 5 DRV S基因组的扩增结果及序列分析 |
| 5.1 DRV S基因组的扩增 |
| 5.1.1 S2基因的扩增 |
| 5.1.2 S3基因的扩增 |
| 5.1.3 S4基因的扩增 |
| 5.2 DRV S组基因序列分析 |
| 5.2.1 DRV S2基因核苷酸序列遗传进化分析结果 |
| 5.2.2 DRV S3基因核苷酸序列遗传进化分析结果 |
| 5.2.3 DRV S4基因核苷酸序列遗传进化分析结果 |
| 讨论 |
| 1 DRV致BHK-21细胞病变特点 |
| 2 各株DRV细胞凋亡与病毒增殖特点 |
| 3 DRV S组基因分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）当前鸭病流行现状及防控对策（论文提纲范文）
| 1 鸭瘟 |
| 2 鸭病毒性肝炎 |
| 3 呼肠孤病毒病 |
| 4 鸭出血性卵巢炎 |
| 5 鸭疫里默氏杆菌病 |
| 6 小结 |
（5）禽（番鸭）呼肠孤病毒TaqMan探针荧光RT-PCR诊断方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 一：禽（番鸭）呼肠孤病毒 |
| 1 呼肠孤病毒的研究现状 |
| 1.1 呼肠孤病毒科简介 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒的历史、发生和分布 |
| 1.3 禽呼肠孤病毒简介 |
| 2 病毒的理化特性 |
| 3 分子生物学特性 |
| 3.1 基因组 |
| 3.2 基因组编码的蛋白 |
| 4 病毒的致病性 |
| 5 禽（番鸭）呼肠孤病毒的研究现状 |
| 5.1 简介 |
| 5.2 临床症状及流行病学 |
| 5.3 病理变化 |
| 6 禽呼肠孤病毒的诊断 |
| 6.1 血清学诊断方法 |
| 6.2 分子生物学诊断方法 |
| 6.3 鉴别诊断 |
| 7 防治 |
| 二：实时荧光定量PCR（REAL-TIME FLUORESCENCE QUANTITIVE PCR.REAL-TIME FQ-PCR） |
| 1 FQ-PCR 的原理 |
| 2 两个重要的概念 |
| 2.1 荧光域值(Threshold) |
| 2.2 循环阈值(Cycle Threshold value,Ct) |
| 3 荧光标记与探针类型 |
| 3.1 SYBR Green I 荧光染料 |
| 3.2 分子信标（molecular beacon） |
| 3.3 双杂交探针法（Lightecycler 法） |
| 3.4 TaqMan 探针 |
| 三：番鸭呼肠孤病毒病的危害及本研究的目的 |
| 实验研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 番鸭与番鸭胚 |
| 1.2 毒株 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.3.1 主要试剂 |
| 1.3.2 主要仪器及材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 引物及探针的设计与合成 |
| 2.2 病毒的扩增 |
| 2.3 病毒核酸的提取 |
| 2.4 反应条件的优化 |
| 2.4.1 反转录前病毒核酸的变性与不变性的比较 |
| 2.4.2 反应退火温度的选择 |
| 2.4.3 引物和探针的最佳配比浓度 |
| 2.5 标准品的制备 |
| 2.5.1 重组质粒的构建 |
| 2.5.2 重组质粒的提取及鉴定 |
| 2.5.3 标准品的制备 |
| 2.6 重复性、稳定性试验 |
| 2.7 标准曲线的制作 |
| 2.8 灵敏度及特异性试验 |
| 2.9 该诊断方法的应用 |
| 2.9.1 人工攻毒番鸭肝脏组织中病毒核酸的检测 |
| 2.9.2 临床样品的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 反转录前病毒核酸的不变性与变性的比较 |
| 3.2 反应退火温度的选择 |
| 3.3 引物和探针的最佳配比浓度(终浓度) |
| 3.4 重组质粒的提取及鉴定 |
| 3.5 重复性、稳定性试验 |
| 3.6 标准曲线的建立 |
| 3.7 灵敏度试验 |
| 3.8 特异性试验 |
| 3.9 攻毒番鸭肝脏组织中病毒核酸的检测 |
| 4.0 临床样品的检测 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（6）雏番鸭呼肠孤病毒病的防治试验（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 免疫保护试验 |
| 1.3 不同制剂的治疗对比试验 |
| 1.4 存活番鸭的扑杀剖检 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（7）禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗的制备和免疫效果的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 综述 |
| 1.禽呼肠孤病毒研究现状 |
| 1.1 禽呼肠孤病毒简介 |
| 1.2 禽呼肠孤病毒历史 |
| 1.3 禽呼肠孤病毒特征 |
| 1.4 禽呼肠孤病毒的诊断 |
| 1.5 防治方法的研究 |
| 2.酶联免疫吸附试验概述 |
| 2.1 酶免疫技术简介 |
| 2.2 酶免疫技术的发展 |
| 2.3 酶联免疫吸附试验的原理 |
| 2.4 酶联免疫吸附试验的类型 |
| 2.5 用的酶及显色底物 |
| 2.6 酶标记物的制备 |
| 3.兽用疫苗研究现状 |
| 3.1 兽用生物制品简介 |
| 3.2 兽用疫苗研究现状 |
| 材料与方法 |
| 1.抗原抗体及酶标二抗的制备 |
| 2.间接ELISA检测番鸭呼肠孤病毒抗体方法的建立 |
| 3.禽(番鸭)呼肠孤病毒灭活疫苗的制备 |
| 4.禽(番鸭)呼肠孤病毒油乳剂灭活苗的质量检验 |
| 实验结果 |
| 1.抗原抗体制备与二抗的酶标 |
| 2.间接ELISA检测禽(番鸭)呼肠孤病毒抗体方法的建立 |
| 3.禽(番鸭)呼肠孤病毒病油乳剂灭活苗的制备 |
| 4.试制疫苗的质量检验 |
| 分析与讨论 |
| 1.对实验方法与操作的讨论 |
| 2.对实验结果的讨论 |
| 3.实验的创新之处 |
| 4.实验存在的问题 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）我国番鸭呼肠孤病毒病的研究现状（论文提纲范文）
| 1 病原 |
| 1.1 病原特性 |
| 1.2 培养特性 |
| 1.3 病毒的抗原性 |
| 1.4 病原分类地位的探讨 |
| 2 流行病学 |
| 3 临诊症状 |
| 4 病理变化 |
| 4.1 剖检变化 |
| 4.2 显微病理变化 |
| 5 鉴别诊断 |
| 6 防控措施 |
| 7 结语 |
（10）番鸭花肝病流行病学诊断与防制（论文提纲范文）
| 1 流行病学 |
| 2 症状和病变 |
| 3 病原鉴定 |
四、番鸭的一种新病——“花肝病”（论文参考文献）
- [1]新型鸭呼肠孤病毒间接ELISA检测方法的建立及应用[D]. 田昂. 山东农业大学, 2021
- [2]不同致病力MDRV双重RT-PCR检测方法建立及诱导细胞凋亡研究[D]. 周五朵. 福建农林大学, 2014(05)
- [3]鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞凋亡的研究[D]. 逯艳云. 华中农业大学, 2013(02)
- [4]当前鸭病流行现状及防控对策[J]. 张大丙. 中国家禽, 2012(07)
- [5]禽（番鸭）呼肠孤病毒TaqMan探针荧光RT-PCR诊断方法的建立及应用[D]. 严进. 福建农林大学, 2009(12)
- [6]雏番鸭呼肠孤病毒病的防治试验[J]. 曾强,张济培,陈武活,陈建红. 中国兽医杂志, 2008(08)
- [7]禽（番鸭）呼肠孤病毒感染油乳剂灭活苗的制备和免疫效果的研究[D]. 黄梅清. 福建农林大学, 2006(12)
- [8]我国番鸭呼肠孤病毒病的研究现状[J]. 郑腾,曹治云,张志灯. 畜牧与兽医, 2005(08)
- [9]番鸭花肝病(暂定名)病原的分类地位研究[A]. 王林川,陈庆华,徐昌领,鄢志强,陈芳艳,王政,何辉,赵赣,王丙云,计慧琴,冯军,刘富来. 中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集（下册）, 2004
- [10]番鸭花肝病流行病学诊断与防制[J]. 黄爱芳,刘思伽. 动物医学进展, 2004(03)