一、结膜细胞外基质(ECM)的研究（论文文献综述）
张红超[1]（2021）在《102例犬细菌性角膜溃疡的流行病学调查及手术对深层角膜溃疡的疗效观察》文中研究表明角膜溃疡（Cornea Ulceration）是兽医临床较常见的眼科疾病,其病原菌主要为伪中间葡萄球菌（Staphylococcus Pseudintermedius）。目前,治疗角膜溃疡的方法是药物治疗和药物治疗联合手术治疗,如联合带蒂板层角膜移植手术或带蒂结膜瓣遮盖术。但是,对这两种手术的临床疗效比较没有系统的研究。本研究首先对郑州地区102例角膜溃疡犬进行流行病学分析,然后依据流行病学调查情况,用主要致病菌构建犬角膜溃疡模型,进而观察带蒂板层角膜移植术和带蒂结膜瓣遮盖术对角膜溃疡的疗效。现将研究情况报告如下:试验一:102例犬角膜溃疡的流行病学调查及细菌的分离鉴定与耐药性分析收集2017年6月至2019年12月间郑州市三家宠物医院收治的102例犬角膜溃疡病例,统计其发病原因、年龄、性别、品种、治疗方法及预后等,并使用无菌生理盐水浸湿的细胞刷蘸取溃疡灶样品,对采集的样品进行细菌培养与纯化,然后使用MALDI Biotyper系统对分离的菌株进行鉴定。同时,将所分离的主要菌株做眼科常用药物的敏感性试验。试验结果如下:（1）发病率较高的品种为贵宾、比熊、京巴、柯基和混血犬;年龄从2月龄至19岁不等,平均年龄为5.8±0.54岁,发病原因主要以外伤（22例,21.57%）和干眼症（14例,13.73%）为主。（2）细菌培养阳性99例,以伪中间葡萄球菌感染的混合感染病例为主;体外抑菌有效的抗生素有头孢甲肟（96.94%）、利福平（98.98%）、妥布霉素（97.96%）、左氧氟沙星（93.88%）和环丙沙星（96.94%）;而对四环素（91.84%）、红霉素（96.94%）和氯霉素（51.02%）有耐药性。试验二:不同治疗方法对伪中间葡萄球菌性犬角膜溃疡的疗效观察选用15只健康成年比格犬,使用微量注射器吸取伪中间葡萄球菌菌液注入角膜基质层内构建犬角膜溃疡模型。造模后48 h,使用0.5%聚维酮碘生理盐水溶液对溃疡灶进行冲洗。同时滴加氧氟沙星滴眼液和玻璃酸钠滴眼液12次/d,两种药物用药间隔为1 min。造模成功后,随机选择3只犬用于抗生素治疗组,12只犬用于抗生素联合手术治疗组,手术治疗组在术眼消毒后进行手术治疗,其中左眼行带蒂板层角膜移植术,右眼行带蒂结膜瓣遮盖术。并于术后7、14、21、28、35和42 d统计相关临床指标和信息。根据临床观察指标和症状进行评分。试验结果如下:（1）单纯抗生素治疗组实验犬在治疗后36-46h内均出现角膜穿孔,前房塌陷,虹膜脱出,羞明,流泪,眼分泌物增多;角膜大面积水肿、不透明,多象限内可见新生血管。单纯抗生素治疗组治疗无效。（2）手术治疗组角膜浑浊度评分:术前两组间无统计学差异（p>0.05）;术后7、14和21 d带蒂板层角膜移植组评分显着或极显着高于带蒂结膜瓣遮盖组（p<0.01或p<0.05）;术后28d,两组间无统计学差异;术后35和42d,带蒂板层角膜移植组评分显着或极显着低于带蒂结膜瓣遮盖组（p<0.01或p<0.05）。（3）手术治疗组角膜新生血管评分:术前及术后7d,两组间无统计学差异（p>0.05）;术后14、21、28和35d,带蒂板层角膜移植组评分显着或极显着高于带蒂结膜瓣遮盖组（p<0.01或p<0.05）;术后42d,两组间无统计学差异（p>0.05）。（4）手术治疗组角膜水肿面积评分:术前两组间无统计学差异（p>0.05）;术后7和14 d,带蒂板层角膜移植组评分显着或极显着高于带蒂结膜瓣遮盖组（p<0.01或p<0.05）;术后21、28、35和42d,两组间无统计学差异（p>0.05）。（5）手术治疗组泪液量检测结果:术前及术后2-6d,两组间无统计学差异（p>0.05）;术后8-18、32、38和42d,带蒂板层角膜移植组评分极显着低于带蒂结膜瓣遮盖组（p<0.01）;在其余时间点,两组间无统计学差异（p>0.05）。（6）手术治疗组眼内压检测结果:术前及术后2-6d,两组间无统计学差异（p>0.05）;术后8-18、32、38和42 d,带蒂板层角膜移植组评分极显着低于带蒂结膜瓣遮盖组（p<0.01）;在其余时间点,两组间无统计学差异（p>0.05）。试验三:不同治疗方法对伪中间葡萄球菌性角膜溃疡犬角膜组织病理学及相关细胞因子表达的影响将抗生素联合手术治疗组的12只实验犬随机分成四组,分别于术后14、28、35和42 d进行手术采取角膜。将采集的角膜沿手术位置一分为二,一半用于组织切片制作,一半用于荧光定量检测细胞因子。试验结果如下:（1）单纯抗生素治疗组的组织病理学变化:角膜上皮层缺失,结构不完整,内皮细胞层部分区域缺失,后弹力层缺失。溃疡灶内可见新生肉芽组织,但无法完全闭合溃疡灶。（2）手术治疗组的组织病理学变化:带蒂板层角膜移植组角膜结构完整,角膜上皮层重新上皮化,纤维蛋白排列整齐有序,后弹力层和内皮层结构完整。带蒂结膜瓣遮盖组溃疡灶处完全覆盖结膜上皮,细胞密度高,排列杂乱无章,基质层可见新生血管,纤维蛋白排列无序。后弹力层和内皮层结构完整。（3）炎性因子基因表达的变化:术后14和28 d,与带蒂结膜瓣遮盖组相比,带蒂板层角膜移植组中TLR2、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA相对表达量极显着升高（p<0.01）;术后35d,与带蒂结膜瓣遮盖组相比,带蒂板层角膜移植组中TLR2和TNF-α的mRNA相对表达量极显着升高（p<0.01）,其余炎性因子基因表达量在两组间无统计学差异（p>0.05）;术后42d,两组各炎性因子基因表达量无统计学差异（p>0.05）。（4）生长因子基因表达的变化:术后14 d,与带蒂结膜瓣遮盖组相比,带蒂板层角膜移植组中VEGF、FGF和TGF的mRNA相对表达量均显着或极显着升高（p<0.05或p<0.01）。术后28d,两组各细胞因子的mRNA相对表达量无统计学差异（p>0.05）。术后35和42 d,与带蒂结膜瓣遮盖组相比,带蒂板层角膜移植组中TGF的mRNA相对表达量显着降低（p<0.05）,其余生长因子的mRNA相对表达量无统计学差异（p>0.05）。试验四:带蒂板层角膜移植术对犬深层角膜溃疡临床病例的疗效观察对犬深层角膜溃疡临床病例采取带蒂板层角膜移植术后,连续观察至60 d。术后泪液量均在正常值范围内波动,眼内压在术后5-11 d内低于正常值范围,其余时间点均在正常值范围内。没有病例出现重复感染,术后恢复效果良好,视力均得到恢复。综上所述,郑州市102例犬角膜溃疡病例中的犬品种多为泰迪和短头颅犬,感染的细菌主要为伪中间葡萄球菌且对红霉素、氯霉素和四环素类药物耐药;板层角膜移植手术的术后恢复效果优于结膜瓣遮盖术,角膜愈合与透明度良好,纤维蛋白排列整齐有序,上皮层结构完整。
章爽[2]（2021）在《真菌性角膜炎患眼及对侧未感染眼泪液中炎性细胞因子及MMP-9的表达变化及其意义》文中提出目的:检测真菌性角膜炎（fungal keratitis,FK）患者双眼泪液中炎性细胞因子及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-9表达水平,同时观察这些炎性细胞因子与患眼角膜知觉及疼痛,对侧未感染眼泪膜功能的关系。方法:前瞻性采集泪液标本60份（其中FK患眼组20份,对侧未感染眼组20份,健康对照组眼20份）。采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）对泪液中白介素（interleukin,IL）-1β、IL-10、IL-17、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α及MMP-9的含量进行测定,每眼取泪液标本约50～60μl。同时对疼痛视觉模拟评分（visual analogue scale,VAS）、泪膜破裂时间（tear breakup time,TBUT）、双眼基础泪液分泌水平（Schirmer I test,SIT）和角膜知觉指标进行测定,用SPSS22统计软件进行统计学分析,采用Kruskal-Wallis H及Mann-Whiney U检验进行组间比较,采用Spearman‘s进行各个指标间的相关性分析。结果:与健康对照组相比,我们发现FK患者双眼泪液中的IL-1β、IL-10和IL-17含量均升高（P<0.05）,且对侧未感染眼泪液中的IL-10水平高于感染眼（P<0.05）,而泪液中TNF-α及MMP-9含量仅在患眼中升高（P<0.05）。FK患者感染眼的角膜知觉较健康对照组眼明显降低（P<0.05）,对侧未感染眼的角膜知觉较健康对照组眼略降低,但差异无明显统计学意义（P>0.05）,而与健康对照组眼相比,对侧眼的TBUT和SIT明显降低（P<0.05）,且与IL-1β、IL-17水平呈现负相关（P<0.05）,SIT与MMP-9水平也呈现负相关（P<0.05）,而健康对照组泪液中IL-1β、IL-10、IL-17、TNF-α及MMP-9与TBUT和SIT指标之间无明显相关性（P>0.05）,患眼角膜知觉和VAS评分与IL-1β、IL-17及TNF-α含量呈正相关（P<0.05）,与IL-10含量水平呈现负相关（P<0.05）,与MMP-9无明显相关性（P>0.05）。结论:单侧FK患者会出现双眼泪液炎性因子的改变,且表现出与疼痛,角膜知觉及泪膜功能改变相关。
徐丽娟[3]（2020）在《吡柔比星通过诱导细胞凋亡和自噬抗兔结膜纤维化》文中研究表明目的:本研究首先在新西兰白兔眼中构建结膜纤维血管组织模型并进行鉴定,然后通过体内和体外实验,探讨吡柔比星（THP）对新西兰白兔结膜的抗纤维作用及机制。方法:本研究分为三部分:第一部分选择3只健康新西兰白兔作为未手术对照组,另外9只新西兰白兔采用角膜缘干细胞切除联合碱烧伤法构建结膜纤维血管组织模型,分别于造模后1月﹑2月和3月将模型与对照组﹑人原发翼状胬肉及人复发翼状胬肉进行形态学﹑组织学及组织化学特征（Vimentin,α-SMA,TGF-β1/2及collagen-I表达量）的比较,评估该模型应用于后续药物实验的可能性,并选择合适的造模时间节点。丝裂霉素C（mitomycin C,MMC）作为第二部分和第三部分的阳性对照药物。在第二部分实验中,首先用组织块法在体外培养原代兔结膜成纤维细胞（rabbit conjunctiva fibroblasts,RCF）,并用成纤维细胞特异性标记物Vimentin进行鉴定。将RCF用THP或MMC作用5分钟后洗脱,继续培养细胞24小时（蛋白印迹法[Western Blotting,WB]及Ad-m Cherry-GFP-LC3B转染试验）或48小时（其他细胞实验）。在观察时间点用荧光显微镜观察细胞形态变化,用化学发光法测定细胞活力,用流式细胞仪检测细胞周期及死亡细胞,用WB检测凋亡和自噬相关蛋白的表达,通过这一部分实验探讨THP对RCF增殖和凋亡的影响及相关作用机制,筛选出THP对RCF的有效作用浓度以应用于下一步动物实验。同时,我们观察了THP作用于体外培养人角膜上皮细胞（human cornea epithelial cells,HCECs）后细胞形态﹑凋亡及细胞周期分布情况。第三部分实验中我们首先选择了9只健康新西兰白兔行双眼构建结膜纤维血管模型。造模成功后行纤维血管组织切除,根据术中联合用药不同分为4组:DMEM组（阴性对照组）,不同浓度THP组（组2,组3）,MMC组（组4,阳性对照组）。术后随访3个月,比较各组结膜纤维血管组织复发情况及副作用,评估THP对预防结膜纤维血管组织切除术后复发的有效性及安全性。3个月后,获取手术部位结膜组织进行HE和免疫组化染色（cleaved caspase 3和LC3B）,评估THP对结膜组织结构完整性﹑细胞凋亡及自噬的影响。之后我们采用C57BL/6小鼠进一步评估了THP对角膜﹑心脏﹑肝脏和肾脏的毒性损害:选择3只作为未手术组（组1）,另外12只双眼角膜去上皮后用药物作用5分钟后洗脱,根据不同的药物分4组:DMEM组（阴性对照组,组2）,不同浓度THP组（组3,组4）,MMC组（组5,阳性对照组）,观察比较各组间角膜上皮愈合情况;1周后获取小鼠眼球﹑心脏﹑肝脏及肾脏并进行免疫组化鉴定,评估药物对上述组织的毒性损害。结果:本研究中所有造模的新西兰白兔眼中均形成了结膜纤维血管组织,该模型与人复发胬肉具有相似的以下特征:三角形外观,大量的胶原纤维沉积及上皮下新生血管形成,其中3个月模型相似度最高,因此被选择应用于后续药物的动物实验研究。在细胞水平,THP和MMC均呈浓度依赖性地抑制RCF增殖,将细胞周期阻滞于G0/G1期,其中THP对RCF的半数抑制浓度(IC50)为0.01 mg/m L,为MMC的1/20(IC50=0.2 mg/m L)。0.005 mg/m L THP通过上调Beclin 1,Atg 5/12复合体及LC3B激活了RCF自噬通路,而0.01 mg/m L THP通过激活线粒体途径的凋亡通路诱导RCF发生凋亡,并且以早期凋亡为主。THP和MMC均抑制HCECs增殖,诱导细胞凋亡,0.005和0.01 mg/m L THP诱导HCECs早期凋亡为主,而0.2 mg/m L MMC诱导细胞晚期凋亡为主,3组药物均将HCECs细胞周期阻滞于G2/M期。在动物实验中,0.005 mg/m L THP及0.01 mg/m L THP均与0.2 mg/m L MMC相似,未观察到新西兰白兔结膜纤维血管组织切除术后复发,而对照组术后复发率为44.4%（4/9）。0.005 mg/m L THP组未观察到明显副作用;但0.01 mg/m L THP组观察到2例（2/3）角膜混浊,1例（1/3）巩膜溶解;0.2 mg/m L MMC组观察到1例（1/3）角膜上皮延迟愈合。免疫组化结果显示:0.005 mg/m L THP组胶原纤维排列规则,结膜组织中出现显着增多的自噬细胞;而0.01 mg/m L THP组与0.2mg/m L MMC组胶原纤维排列稀疏,均在结膜组织中出现明显增多的凋亡细胞。在小鼠角膜损伤愈合过程中,0.005 mg/m L THP术后第一天愈合面积显着小于对照组,术后第二天完全愈合;0.01 mg/m L THP及0.2 mg/m L MMC术后1-4天愈合面积显着小于对照组,术后6-7天达到完全愈合。三组药物均未破坏角膜结构,但是0.01 mg/m L THP和0.2 mg/m L MMC组角膜基质中观察到了多形核细胞;三组药物均未对心脏﹑肝脏及肾脏产生毒性损害。结论:通过角膜缘干细胞切除联合碱烧伤法可以在新西兰白兔结膜中诱导形成纤维血管组织,该模型与人复发胬肉相似,未来可能可以应用于眼表纤维化疾病的基础和临床研究;在体外和体内实验中,THP表现出对RCF的抗纤维潜能:抑制成纤维细胞增殖并将细胞周期阻滞于G0/G1期,呈浓度依赖性地诱导细胞自噬﹑激活线粒体途径的凋亡通路;0.005 mg/m L THP可能具有有效且安全地预防兔结膜纤维血管组织切除术后复发的作用。
陈芳圆,周清[4]（2020）在《脱细胞技术及其在眼表重建组织工程中的应用研究》文中研究指明严重眼表疾病的治疗一直是困扰眼科医师的难题,目前认为组织工程学方法可解决这一难题。组织工程可重建眼表并恢复眼表功能,而脱细胞支架是构建组织工程的关键环节之一。可采用化学法、物理法以及生物法制备脱细胞支架,但单一的制备方法很难获得良好的去细胞效果,因而大部分学者建议采用联合的方法制备,其在最大化脱细胞的前提下,可更多地保存细胞外基质的生理结构和生物活性,减少不良反应。目前用于眼表疾病的脱细胞支架包括脱细胞角膜基质和脱细胞结膜基质,并已在试验中取得了一定的效果。
徐佩芳[5]（2020）在《眼睑缺损修复中组织工程睑板替代材料的应用研究》文中进行了进一步梳理第一部分新型支化聚乙烯多孔支架材料的制备及其生物相容性评估目的利用新型支化聚乙烯弹性体作为材料本体构建可用于软组织修复的组织工程多孔支架。探索制备聚乙烯多孔支架的可行性,获得具有合适孔隙率,孔连通性及孔径大小的支架。观察材料本体及多孔支架的理化特征,评估材料体外及体内生物相容性。以期构建出具有良好生物相容性,能快速被组织整合的多孔支架材料,为后续作为睑板替代材料提供可能。方法选用明胶粒子作为致孔剂制备支化聚乙烯支架。扫描电镜观察本体材料及支架的微观结构,排乙醇法测定支架孔隙率。浸提液法检测材料对NIH/3T3成纤维细胞和人静脉内皮细胞的毒性,FDA活细胞染色观察细胞在材料表面黏附与增殖,共聚焦显微镜观察三维培养下人静脉内皮细胞在支架上的细胞行为。大鼠背部皮下植入支架,通过组织学及分子生物学以评估材料体内宿主组织反应。结果支化聚乙烯弹性体结构疏松,表面疏水。以孔径280-480?m的明胶颗粒为模板可以制备结构稳定,孔隙率可达90%,且孔连通性良好的多孔支架。CCK-8试验检测支化聚乙烯浸提液对NIH/3T3成纤维和人静脉内皮细胞毒性,各时间点细胞增殖与空白对照无显着差异（P>0.05）。人静脉内皮细胞在材料表面黏附与增殖优于NIH/3T3成纤维细胞。人静脉内皮细胞在支架上三维培养7天后,支架被完全内皮细胞化。植入大鼠背部后,支架只引起短暂且轻微的炎症反应,快速的血管化,以及适量的胶原沉积。分子生物学结果显示炎症因子表达处于较低水平,而血管化和胶原沉积相关基因表达上调,与组织学结果基本一致。结论支化聚乙烯弹性体具有良好的可加工性和成膜性能。明胶模板致孔剂法可适用于制备孔隙率高,孔径适度,孔连通性良好的多孔支架。浸提液实验及细胞直接接触实验提示材料在体外没有明显细胞毒性。多孔支架体内植入后引起轻微的炎症反应,并能被快速的纤维血管化,材料与宿主组织整合良好。第二部分新型支化聚乙烯睑板材料应用于眼睑损伤修复的研究目的评估天然睑板及支化聚乙烯多孔支架的力学性能及微纳结构。分析评价其作为睑板替代材料在原位植入兔眼睑缺损中的修复效果,为支化聚乙烯支架材料在组织工程中的应用提供新的思路和实验基础。方法获取兔新鲜睑板组织,观察其力学性能,组织学组成及生物学功能。分析支化聚乙烯支架和Medpor对照材料的力学性能和微纳结构,评估其与天然睑板的性能及结构仿生可行性。建立兔睑板缺损动物模型,原位植入支化聚乙烯支架及Medpor材料,通过病理组织切片H&E和Masson染色观察炎症反应,支架位置,组织整合等情况,综合评估材料与眼睑组织的相互作用。结果兔睑板由致密纤维结缔组织包裹规律排列的睑板腺组成,平均拉伸模量为0.92±0.1 MPa,断裂伸长率为50.8±10.4%。支化聚乙烯支架及Medpor植片的弹性模量及断裂伸长率为分别0.8±0.1MPa,76.2±2.8%,和30.2±4.5Mpa,7.0±1.1%。成功构建兔睑板缺损模型,术后4周,如果没有进行睑板重建,睑板表现为疤痕收缩,形成眼睑切迹。植入支化聚乙烯支架组修复效果优于Medpor植入组。经H&E染色可见,支化聚乙烯支架内部被纤维血管组织整合,材料位置稳定,而Medpor内部组织浸润不足,部分出现移位及暴露。Masson染色结果显示,支化聚乙烯支架和Medpor支架引起的纤维包裹厚度为134.4±24.9?m和271.6±46.5?m。结论支化聚乙烯多孔支架具有与天然睑板相似的力学性能,相比于Medpor材料在植入眼睑后能更快速被纤维血管化,与宿主整合,具有更好的稳定性,且材料刚度与组织相近,可以支持和适应眼睑形态。本研究尝试构建结构和力学性能与组织匹配的替代材料,为眼睑重建提供了新的材料来源和思路。第三部分仿睑板-结膜双层复合支架的制备及其对眼睑损伤修复的研究目的基于睑板-结膜组织的组成及结构,探索构建可以同时重建睑板和结膜组织的双层复合材料。微观层面分析双层支架材料对细胞行为的影响,进一步原位评估该材料对眼睑后层缺损修复效果。方法通过将软材料胶原/壳聚糖（Col/CS）复合至硬材料聚富马酸丙二醇酯/甲基丙烯酸羟乙酯（PPF-HEMA）获得双层复合支架。扫描电镜观察支架形态及孔结构,排乙醇法测量支架孔隙率,通用力学试验机测试材料的压缩及拉伸性能,根据支架在磷酸盐缓冲液中的质量损失分析体外降解性能。观察人结膜上皮细胞（Cj ECs）在支架中的细胞黏附,增殖活性,迁移行为等。构建兔眼睑后层缺损模型,原位植入评估双层支架的修复效果。结果成功构建了PPF-COL双层复合支架,韧性的PPF-HEMA支架做为骨架材料,支撑柔性Col/CS内衬,模拟眼睑后层睑板-结膜双层结构。双层支架具有高孔隙率,约90%,表层Col/CS及底层PPF-HEMA孔径分别约为95?m和235?m,体外降解稳定,降解12周时,原有宏观及微观结构保持良好。Cj ECs细胞在双层支架中增殖明显高于单纯PPF-HEMA支架,且趋向于向Col/CS表面迁移,汇合。在眼睑重建模型中,复合一定厚度的Col/CS的双层支架可以明显促进结膜缺损闭合,再上皮化,再生组织中结膜上皮特异性染色CK4和MUC5AC阳性。结论Col/CS与PPF-HEMA骨架复合后,双层支架在体外表现出更好的细胞黏附和增殖能力。在兔眼睑后层缺损修复中,具有较好的重建效果,同时支持功能性结膜组织再生。本研究结果为组织工程眼睑缺损重建的理想替代物的设计和构建提供了新的概念。
梁玲玲[6]（2019）在《ATRA对TGF-β1诱导的HconF细胞纤维化作用的研究》文中研究说明青光眼是世界第一的不可逆性致盲性眼病,是一组以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的疾病,病理性眼压增高是其主要的危险因素。尽管其损害机制至今尚不完全明确,但大量研究表明眼压水平仍是影响青光眼性视神经损害的主要因素,眼压越高对视神经的损害越为严重。滤过性手术现今仍是临床上治疗青光眼主要的手术方式。术后五年滤过泡存活率不超过50%,其主要失败原因是滤过区组织发生过度瘢痕化反应。目前临床常在术中或术后联合应用药物丝裂霉素（Mitomicin C,MMC）或5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）以抑制滤过道瘢痕化。但是这类抗代谢药物的细胞毒作用常常导致滤过泡渗漏、角膜上皮功能失调甚至迟发性眼内炎、黄斑变性等并发症。因此探索新的更加安全有效的抗瘢痕化药物具有重大意义。人结膜成纤维细胞（human conjunctival fibroblast,HconF）是存在于结膜下结缔组织内的具有分化功能的间叶细胞,正常状态下是静止的,手术或炎症等刺激因素激活HconFs并向肌成纤维细胞（Myofibroblasts,MFs）表型转化,启动伤口愈合反应。而HconFs表型转化为MFs是细胞纤维化、滤过道瘢痕化的重要细胞学基础。HconFs活化、聚集的最重要的细胞因子是转化生长因子β（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）,在应急条件下,肥大细胞、成纤维细胞和炎症细胞分泌TGF-β,TGF-β与其受体结合,可以激活P38的磷酸化、Smad2和Smad3的表达及核转移。TGF-β一方面刺激细胞外基质合成,另一方面诱导HconFs向收缩性和活性更强的MFs转化。TGF-β表达于正常房水中,且在伤口愈合过程中结膜下TGF-β的三种单体的表达都有明显增高,外源性TGF-β也可诱导HconFs和MFs为主的细胞增殖、迁移和胶原收缩。针对TGF-β这一调控靶点的许多研究发现体内或体外抑制TGF-β都可有效抑制成纤维细胞纤维化、抑制瘢痕形成。我们的前期研究结果表明,TGF-β1可以促进HconF细胞增殖,促进HconF细胞由G1期进入S期和G2/M期,使MF细胞的标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表达增加,促进HconF细胞迁移和细胞外基质合成,表明TGF-β1可促进人结膜成纤维细胞的纤维化,可以在体外很好地模拟青光眼滤过术后创伤愈合过程。维甲酸（retinoic acid RA）是维生素A的活性代谢产物,全反维甲酸（all-trans retinoic acid ATRA）是其中的一个亚型。ATRA在胚胎发育、生殖、视觉、细胞增殖、分化及凋亡以及炎症的过程中发挥着重要的生理作用。有研究表明,RA通过多种机制在肝纤维化、肾脏纤维化、肺组织纤维化等多种纤维化性疾病中发挥重要的作用,RA能够抑制细胞外基质形成,并且调节TGF-β信号传导通路。我们前期实验初步发现ATRA能够抑制TGF-β诱导的HTFs的细胞外基质的形成及细胞收缩,具有潜在的抑制结膜纤维化的作用。目的 应用ATRA作用于TGF-β1诱导的HconFs细胞,探讨ATRA抗纤维化作用及其机制,为探索新的更加安全有效的抗瘢痕化药物提供新的方向。方法（1）将ATRA作用于TGF-β1诱导的HconFs,利用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡,采用细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移功能,采用Western blot方法检测细胞外基质（extracellular matrix,ECM）及PI3K/AKT和磷酸化的PI3K/AKT的水平,分析ATRA对TGF-β1诱导的HconFs纤维化的影响及可能的机制。（2）建立兔眼滤过性手术模型,检测ATRA对兔眼小梁切除术后滤过道瘢痕化的影响。术前及术后测量眼压;术后利用眼前段照相观察滤过泡的形态及面积;四周后处死动物,完整摘取双眼眼球,采用免疫组织化学法检测滤过泡结膜组织中α-SMA、FN、collagen-Ⅰ、Fibrocectin、Smad2/Smad3及磷酸化的PI3K/AKT的表达,分析ATRA对青光眼滤过性手术滤过道瘢痕化的影响及可能的机制。（3）将PI3K抑制剂LY294002作用于TGF-β1诱导的HconFs,利用CCK-8法检测细胞活力,采用Transwell实验检测细胞的迁移功能,采用Western blot方法检测细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的水平。结果（1）发现ATRA能够抑制TGF-β1诱导的HconFs细胞的增殖,ATRA能够促进TGF-β1诱导的HconFs细胞的凋亡;证实ATRA能够抑制TGF-β1诱导的HconFs的迁移;ATRA能够抑制collagen-Ⅰ和fibronectin两种ECM蛋白的表达。由以上结果我们可以得出结论:ATRA能够抑制TGF-β1诱导的HconFs细胞的纤维化。进一步我们发现TGF-β1诱导的HconFs细胞PI3K/AKT磷酸化的水平能够被ATRA抑制,由此我们可以推测,ATRA调控HconFs细胞纤维化的过程,可能通过PI3K/AKT信号通路来实现的。（2）ATRA能够延长术后滤过泡的存活时间,能够降低滤过泡结膜组织中α-SMA、FN、collagen-Ⅰ、Fibrocectin、Smad2/Smad3及磷酸化的PI3K/AKT的表达,这与体外实验的结果一致,表明ATRA具有抑制青光眼滤过性手术术后滤过泡瘢痕化的作用,并且这一作用可能是通过调控PI3K/AKT信号通路来实现的。（3）PI3K抑制剂LY294002可降低TGF-β1诱导的HconF增殖;可降低TGF-β1诱导的HconF迁移;可减少TGF-β1诱导的细胞外基质fibronectin和collagen-I的合成。结论ATRA可以调控TGF-β1诱导的HConFs细胞迁移、增殖、转化和ECM合成过程;ATRA可能通过PI3K/AKT信号通路调控HConFs细胞的纤维化过程;ATRA能够抑制兔眼滤过术后滤过泡的瘢痕化。PI3K抑制剂LY294002能够抑制HConFs细胞的纤维化;提示ATRA可能会成为一种新的抗滤过泡瘢痕化的药物,PI3K/Akt信号通路可能成为对抗滤过泡瘢痕化的一个新靶点。
郭志侯[7]（2019）在《角膜缘干细胞标志物及其干性相关通路的研究》文中进行了进一步梳理角膜缘干细胞（LSCs）是一种可以被用来作为干细胞生物学基础研究的理想材料。迄今为止,LSCs特异性标志物仍未被确立。本文旨在以小鼠为实验动物模型,利用免疫组化、转录组学和蛋白质组学分析,探究LSCs标志物及其干性相关通路。本研究首先通过HE染色观察角膜缘上皮组织学结构,发现了小鼠角膜缘上皮基底中并未存在Vogt氏栅状皱纹（POV）结构,说明小鼠LSCs可能具有自己独特的niche结构。同时,利用角膜上皮细胞（CECs）、结膜上皮细胞和LSCs已知的可能标志物,对小鼠的眼角膜组织进行免疫组化染色,发现LSCs标志物具有独特的空间表达模式,并推测该结果与年龄因素相关。我们遂以出生前和出生后不同发育时间的小鼠角膜、角膜缘组织为样品进行HE染色和免疫组化染色。通过HE染色观察,发现小鼠角膜发育早期以上皮下基质发育为主,在P14眼睑睁开后,光刺激促进角膜上皮发育,转为以角膜上皮发育为主,且在整个发育过程中也均未观察到POV结构。通过免疫组化染色观察,发现LSCs标志物在发育过程中呈动态表达,按照其在发育过程中CECs表达减弱的时间先后顺序排序如下:Vim>p63>CK15>CK14,说明LSCs标志物的表达具有时间特性,其中Vim的表达仅在E19之前可在小鼠眼角膜的上皮细胞膜上被检测到,CK15的表达在P14之后仅在LSCs可被检测到,而p63和CK14则在CECs持续低表达,说明CK15更适合作为P14后LSCs的标志物。我们进一步利用转录组测序和蛋白质组测序进行LSCs标志物的研究。采用Illumina Hiseq Xten对4周龄小鼠角膜及角膜缘组织进行转录组测序,利用qRTPCR验证测序分析结果可靠（相关系数为0.7598）,通过差异分析获得1907和395个在角膜缘中分别显着性上调和下调的基因。发现显着上调基因的GO条目与离子转运,组织发育调节,视觉感知和细胞粘附等有关,富集到的KEGG通路中ECM-受体相互作用、PI3K-AKT、MAPK通路参与LSCs干性的维持。我们还利用Label-free LC-MS/MS进行蛋白组学的分析,并通过免疫印迹试验验证测序分析结果可靠。通过差异分析获得804和76个分别在角膜缘中显着性上调和下调的蛋白,基于这些差异表达的蛋白进行免疫组化染色和功能注释。通过免疫组化染色,我们发现3个新的LSCs候选标志物,即ALDH3B2、SLC5A8和HSD17B2。通过基于显着上调蛋白的功能注释分析,发现细胞粘附蛋白和Focal粘附通路对LSCs干性表型的维持具有重要的作用。最后,将转录组和蛋白质组数据进行关联分析,获得相对于角膜组织而言,在角膜缘组织的转录水平和蛋白质水平中表达趋势一致的DEGs和DEPs,其相关性为0.7357（斯皮尔曼系数）。然后利用这些表达趋势一致的DEGs和DEPs进行生物信息学分析,发现细胞的外泌体参与CECs和LSCs的信息交流,且在LSCs niche中,细胞外基质蛋白可能作为关键性节点蛋白通过激活Focal粘附、ECM-受体相互作用、PI3K-AKT通路对LSCs的细胞周期、增殖、分化、迁移和存活等多种干性相关表型的维持具有重要作用。综上所述,本研究首次揭示了小鼠LSCs标志物表达的时间光谱,证明了标志物在LSCs表达所特有的时间性。在未能确定持续性的LSCs特异性标志物的情况下,可以根据不同的生理年龄选择相应的标志物识别LSCs。本研究并还首次基于转录组和蛋白质组测序分析,发现了三个新的LSCs候选标志物及其干性相关通路。这些发现为LSCs的识别、分离及其干性的维持提供不同层面的实验数据,为探究LSCs niche内单细胞之间的异质性奠定基础。
陈凯琳[8]（2019）在《溴芬酸钠抑制TGF-β1介导的人翼状胬肉成纤维细胞和人结膜成纤维细胞纤维化的研究》文中研究说明背景与目的翼状胬肉是临床上常见的眼表疾病,是结膜处增生的良性纤维结缔组织及血管,可发展到侵及角膜,其病因不明,多数学者认为该疾病与各种慢性炎症刺激有关,如紫外线照射、沙尘刺激等引起。其主要的病理机制是在慢性炎症刺激下,翼状胬肉前体细胞在活化或升高的细胞因子等作用下发生细胞增殖、迁移、祖细胞上皮向间充质转分化、肌成纤维细胞的激活等。研究发现转化生长因子-β1（transforming growth factor-β 1,TGF-β 1）是在翼状胬肉组织中高表达的一种重要的炎症因子,被认为和翼状胬肉的形成有关。翼状胬肉术后,创伤过度修复造成的病理性纤维化,会导致翼状胬肉的复发。研究表明,非甾体类抗炎药（Non-Steroidal Anti-inflammatory Drugs,NSAIDs）能够减轻炎症反应、逆转上皮间充质细胞转分化、抑制肌成纤维细胞的激活等纤维化过程,能有效降低乳腺癌等纤维化疾病的复发率。另外,研究发现,对比于匹配的结膜组织,环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）在翼状胬肉组织中明显高表达,COX-2抑制剂在体外模拟实验中可以有效抑制翼状胬肉细胞增殖,但其对翼状胬肉细胞的抗纤维化作用及其分子机制仍不明确。因此本学位论文旨在通过体外培养的人原代翼状胬肉成纤维细胞（human pterygium fibroblasts,HPFs）及人结膜成纤维细胞（human conjunctival fibroblasts,HConFs）模型,探究TGF-β1对HPFs及HConFs的细胞外基质生成、肌成纤维细胞激活、细胞迁移及增殖的诱导作用,以及非甾体类抗炎药溴芬酸钠（bromfenac）对TGF-β1诱导的细胞外基质生成、肌成纤维细胞激活、细胞迁移及增殖的作用及其可能的机制。方法首先,将体外培养的HPFs和HConFs细胞分别分为5组,即20 ng/ml TGF-β1刺激（4组）和无TGF-β1刺激的对照组（1组）,在TGF-β1刺激6h,12h,24h,48h后,用Western Blot检测间充质标志物纤连蛋白（fibronectin,FN）,Ⅲ型胶原蛋白（collagen 3,COL3）以及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的蛋白表达水平,另外,在刺激15min,30min,1 h,2h,6h后,同样用Western Blot检测相关信号分子磷酸化水平及其本底蛋白表达水平,包括:AKT,ERK1/2,GSK-3β-S9,smad2/3,p38 MAPK。为研究溴芬酸钠对TGF-β1诱导的细胞外基质生成、肌成纤维细胞激活、细胞迁移及增殖的可能的抑制作用,将HPFs及HConFs细胞分别分成4组,即:对照组;20 ng/ml TGF-β 1处理组;20 ng/ml TGF-β 1+90ug/ml溴芬酸钠同时处理组;90ug/ml溴芬酸钠处理组。各组HPFs及HConFs细胞同时处理48h,然后用Western Blot及免疫荧光检测细胞FN,COL3和α-SMA蛋白表达水平及分布的改变,同样用Western Blot检测相关信号分子的改变,用划线实验检测细胞迁移能力,通过CCK-8实验检测细胞增殖能力。为进一步证明单用溴芬酸钠可能的抑制细胞外基质生成、肌成纤维细胞激活、细胞迁移及增殖的相关标志物的作用,用3种不同浓度溴芬酸钠（即:30ug/ml,60ug/ml,90ug/ml）梯度处理HPFs和HConFs细胞,处理48h后对比无溴芬酸钠刺激的对照组,通过Western Blot及实时定量PCR检测FN,COL3,基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase 3,MMP3）,α-SMA 和 survivin 表达水平的变化,同样用Western Blot检测相关信号分子的改变。为进一步探索溴芬酸钠抑制TGF-β1介导的细胞外基质生成和肌成纤维细胞激活的具体机制,用PI3K抑制剂wortmannin,MEK抑制剂U0126以及GSK-3β抑制剂LiCl和SB216763分别作用于TGF-β1刺激的HPFs及HConFs细胞,以期研究AKT,ERK1/2和GSK-3β信号分子对HPFs及HConFs细胞的细胞外基质生成和肌成纤维细胞激活的影响。用Western Blot检测细胞FN,COL3及α-SMA蛋白表达水平的变化,同样用Western Blot检测相关信号分子的改变。结果TGF-β1暴露48h可以诱导HPFs及HConFs细胞中FN,COL3及α-SMA蛋白表达升高,并促进细胞迁移及增殖。同时加入溴芬酸钠处理可以抑制TGF-β1诱导的FN,COL3及α-SMA蛋白表达升高、细胞迁移及增殖。TGF-β1 通过快速磷酸化 AKT,ERK1/2,GSK-3β-S9,smad2/3,p38 MAPK 等信号分子,从而促进HPFs及HConFs细胞纤维化,其中TGF-β1诱导的p-AKT,p-ERK1/2,p-GSK-3β-S9的水平受到溴芬酸钠的抑制。另外,单用溴芬酸钠处理HPFs及HConFs细胞,不仅在蛋白水平和mRNA水平都抑制了 FN,COL3,α-SMA及survivin的表达,也抑制了信号分子p-AKT,p-ERK1/2,p-GSK-3β-S9的水平。用抑制剂阻断PI3K/AKT通路（wortmannin）,MEK/ERK通路（U0126）或者GSK-3β通路（LiCl或者SB216763）均可以抑制TGF-β1诱导的FN,COL3及α-SMA的表达。使用LiCl失活GSK-3β能够升高p-GSK-3β-S9的水平,但并不能逆转溴芬酸钠对FN,COL3及α-SMA蛋白表达的抑制,相反,用LiC1升高p-GSK-3β-S9的水平伴随着FN,COL3及α-SMA蛋白表达水平的降低。结论溴芬酸钠能够抑制TGF-β1诱导的HPFs及HConFs细胞的胞外基质生成、肌成纤维细胞激活、细胞迁移及增殖。溴芬酸钠通过影响AKT和ERK1/2通路,抑制TGF-β1诱导的细胞外基质生成和肌成纤维细胞激活。而用LiCl或者SB216763抑制GSK-3β的活性,能够抑制TGF-βl诱导的HPFs及HConFs细胞的胞外基质生成、肌成纤维细胞激活。
彭婧利[9]（2018）在《选择性半胱氨酰白三烯受体1（CysLT1R）拮抗剂孟鲁司特调节细胞外基质重塑》文中进行了进一步梳理1前言术后滤过泡瘢痕增生是青光眼滤过手术失败的主要原因之一。滤过手术后,结膜下创口的愈合过程是首先发生炎症反应,之后再上皮化,接着合成细胞外基质（ECM）和收缩结膜创口,最后形成结膜下纤维瘢痕。瘢痕的形成主要来自于创口部位的结膜下组织的过度收缩。多项研究表明,创口区域的人Tenon’s囊成纤维细胞（HTFs）与结膜下瘢痕形成息息相关。HTFs细胞外基质的增殖、迁移、合成和沉积等生物活性在瘢痕形成和滤过通道的阻塞中扮演了关键角色。结膜下滤过泡的伤口愈合反应由各种细胞因子如转化生长因子-β1（TGF-β1）调节。目前,TGF-β1己经成为抗纤维化治疗的重要靶点。孟鲁司特是半胱氨酸白三烯受体1（CysLT1R）的选择性拮抗剂,药理作用是通过阻止半胱氨酸白三烯（CysLT）介导的支气管收缩、血管通透性的增加,和气道炎症细胞聚集来实现的。然而,孟鲁司特抗纤维化的性能在之前较少被关注,仅有极少数研究表明其可以抑制支气管上皮细胞间质转化和纤维化,并抑制成纤维细胞中基质金属蛋白酶和胶原蛋白的产生。2目的研究孟鲁司特对TGF-β1诱导的原代培养的人Tenon’s囊成纤维细胞细胞外基质（ECM）重塑的影响。3方法3.1细胞分离,培养和处理收集10个行斜视手术的患者的结膜下组织,提取分离出Tenon’s囊成纤维细胞。所有细胞均于含有10%胎牛血清,1%L-谷氨酰胺和1%抗生素（青霉素和链霉素）的DMEM培养基中,37℃、95%空气、5%CO2恒温环境中培养。实验采用的为传至3-6代的HTFs.3.2.逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）根据说明书,使用Qiazol试剂从培养的HTFs中提取出总细胞内RNA。将之逆转录成为cDNA。检测CysLT1RmRNA在HTFs中的表达。3.3胶原凝胶收缩测定制备游离胶原蛋白混合物。将0.5ml游离胶原蛋白加入到24孔细胞培养板中。待混合物凝胶化后,将胶原凝胶自培养板孔分离。然后将0.5ml含有TGF-β1和不同浓度孟鲁司特的无血清DMEM加入到每个凝胶孵育。每天测量凝胶的直径以计算凝胶收缩的程度。3.4蛋白印迹分析使用细胞裂解液及EDTA游离蛋白酶抑制剂的混合物来提取经TGF-β 1及不同浓度孟鲁司特干预过的HTFs的总蛋白。然后检测CysLT1R、MMP-1、MMP-3、FAK、paxillin、p-FAK,p-paxillin 和 α-SMA 蛋白含量。3.5免疫荧光显微镜免疫荧光检测CysLT1R在细胞中的定位情况。3.6纤连蛋白和Ⅰ型前胶原C肽的测定用ELISA法测定培养基中的前胶原Ⅰ型纤维连接蛋白和C肽含量。3.7统计分析实验数据以均数±标准差（x±s）表示。使用Tukey-Kramer检验进行统计学分析,P<0.05被认为具有统计学意义。4结果4.1 CysLT1R在HTFs中的表达以人类A431细胞作为阳性对照,RT-PCR结果表明CysLT1R确实在HTFs中表达。通过蛋白质印迹分析（Western bolt）验证HTFs中CysLT1R的蛋白表达。同样的,免疫荧光染色实验显示CysLT1R在HTFs中表达。4.2 TGF-β1 增加 HTFs 中 CysLT1R 的表达接下来,我们研究经TGF-β1干预后CysLT1R的表达模式。我们发现TGF-β1的干预导致CysLT1R的mRNA和蛋白质含量随TGF-β1浓度从0.5至5ng/n1的的增加而持续增长。这表明CysLT1R可能与TGF-β1在HTFs的功能相关。4.3孟鲁司特对TGF-β1诱导的HTFs胶原凝胶收缩的影响孟鲁司特是CysLT1R的选择性拮抗剂。将HTFs与浓度为0,1,10,50μM的孟鲁司特及TGF-β1（0,2.5 ng/ml）干预的情况下共同孵育3天。结果显示孟鲁司特随着浓度的增加逐步改善TGF-β1诱导的凝胶收缩。当孟鲁司特浓度为1,10或50μM时,2.5 ng/ml的TGF-β1对胶原凝胶收缩的刺激作用分别被抑制30%,48%,或55%。将HTFs与浓度0,50μM的孟鲁司特和2.5ng/mlTGF-β1共同孵育5日,发现随着时间推移,孟鲁司特逐步抑制TGF-β1诱导的胶原凝胶收缩。4.4孟鲁司特对MMPs表达和基质合成的影响细胞介导的胶原收缩是由基质金属蛋白酶（MMPs）诱导的。因此,我们评估了孟鲁司特对MMPs表达的影响。Western blot结果显示TGF-β1的干预使MMP-1和MMP-3的表达显着增加,而孟鲁司特以剂量依赖的方式抑制该效应。除了改善基质收缩之外,抑制MMP可以减少基质产生。接下来,我们研究孟鲁司特对MMPs表达的抑制作用是否影响基质的产生。通过使用特定的ELISA法来确定来自HTFs的纤连蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的释放。TGF-β1诱导的纤连蛋白释放和胶原Ⅰ型C末端前肽的分泌增加被孟鲁司特以浓度依赖的方式抑制。4.5孟鲁司特对基质收缩相关蛋白FAK和桩蛋白的磷酸化及α-SMA表达的影响。细胞介导的胶原收缩基质是非常复杂的。粘着斑激酶（FAK）和桩蛋白（paxillin）的磷酸化和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的激活参与了该过程。因此,我们接下来研究了孟鲁司特是否会影响HTFs中FAK和paxillin的磷酸化和α-SMA 的表达。TGF-β1（2.5ng/mL）诱导了 HTF 中 FAK 和 paxillin 的磷酸化,并被孟鲁司特以浓度依赖性方式抑制。然而,FAK和桩蛋白的总量不受TGF-β1或孟鲁司特的影响。Western blot结果显示TGF-β1或孟鲁司特均未影响α-SMA的表达。5结论5.1 CysLT1R 在 HTFs 中表达。5.2 CysLT1R在HTFs中的表达随TGF-β1浓度升高而升高。5.3 TGF-β1诱导MMP-1和MMP-3表达增加及HTFs分泌纤连蛋白和Ⅰ型胶原增加,孟鲁司特抑制了该效应,减轻了细胞基质的收缩和沉积。5.4孟鲁司特能减弱TGF-β1诱导的FAK和桩蛋白的磷酸化,从而减轻的成纤维细胞介导的细胞外基质收缩。5.5孟鲁司特可能是滤过手术后结膜下创口愈合期间抑制瘢痕形成的有效药物。
江威,邹晶,邵毅,高桂平,李云燕,邓军萍,杨璐[10]（2015）在《自制染色干燥细胞外基质胶羊膜生物学特性及修补结膜缺损的实验研究》文中研究说明目的研究自制染色干燥细胞外基质胶羊膜（extracellular matrix amniotic membrane,ECM-AM）的生物活性因子表达情况、生物力学特征以及在兔结膜修补术中的应用效果。方法使用光镜和HE染色对自制染色干燥ECM-AM进行形态学观察,并通过免疫荧光染色对比其与单纯冻干羊膜中不同生物活性因子Laminin 5、β-catenin和CollagenⅣ的表达情况。利用负荷传感器对比自制染色干燥ECM-AM与单纯冻干羊膜的最大承受拉伸力、弹性模量和拉伸长度,且把保存12个月的自制染色干燥ECM-AM应用于兔羊膜-结膜修补术,并在术后2周观察兔结膜愈合情况。结果自制染色干燥ECMAM可以分辨羊膜的折叠处、皱褶及边缘,HE染色表明自制染色干燥ECMAM基底膜的完整度和厚度均优于保存相应天数（12个月）的冻干羊膜。保存12个月的自制染色干燥ECM-AM中Laminin 5、β-catenin和CollagenⅣ均比单纯冻干羊膜要高。自制染色干燥ECM-AM的最大承受拉伸力以及弹性模量均明显高于于单纯冻干羊膜（均为P<0.05）,但二者平均拉伸长度上差异无统计学意义（P>0.05）。自制染色干燥ECM-AM常温保存12个月后应用于兔羊膜-结膜修补术,术后2周羊膜上有兔结膜上皮长入且K19分布于整个结膜上皮细胞,并无明显的排斥反应和炎症反应。结论自制染色干燥ECM-AM含有丰富的生物活性因子,具有优越的生物力学特性,为眼表重建提供了更加安全有效的材料。
二、结膜细胞外基质(ECM)的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、结膜细胞外基质(ECM)的研究（论文提纲范文）
（1）102例犬细菌性角膜溃疡的流行病学调查及手术对深层角膜溃疡的疗效观察（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 角膜溃疡的病因和愈合机制 |
| 1 角膜溃疡的病因与致病机制 |
| 1.1 角膜溃疡的病因 |
| 1.2 角膜溃疡的致病机制 |
| 2 角膜上皮层伤口的愈合机制 |
| 2.1 生长因子/细胞因子在上皮创面愈合中的作用 |
| 2.2 Toll样受体2 |
| 2.3 蛋白酶在上皮创面愈合中的作用 |
| 2.4 细胞外基质(ECM)在上皮创面愈合中的作用 |
| 3 角膜基质伤口的愈合机制 |
| 3.1 愈合过程中角膜细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞转化 |
| 3.2 免疫系统细胞在基质修复中的作用 |
| 3.3 创面愈合过程中基质细胞外基质的改建 |
| 3.4 与基质创面愈合过程相关的信号通路 |
| 第二章 治疗角膜溃疡方法的研究进展 |
| 1 药物治疗 |
| 2 角膜工程生物材料 |
| 2.1 胶原蛋白 |
| 2.2 丝素蛋白 |
| 2.3 明胶 |
| 2.4 脱细胞角膜 |
| 2.5 壳聚糖 |
| 2.6 其他合成聚合物水凝胶 |
| 3 手术治疗 |
| 3.1 角膜溃疡清创术 |
| 3.2 结膜瓣遮盖术 |
| 3.3 羊膜移植术 |
| 3.4 穿透角膜移植术 |
| 3.5 板层角膜移植术 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 102例犬角膜溃疡的流行病学调查及细菌分离鉴定与药敏试验 |
| 1 材料 |
| 1.1 临床病例 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 细菌的分离和纯化培养 |
| 2.3 MALDI Biotyper系统鉴定细菌和细菌保存 |
| 2.4 药物敏感性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病因 |
| 3.2 发病率 |
| 3.3 品种 |
| 3.4 性别和年龄 |
| 3.5 治疗方法 |
| 3.6 治疗效果 |
| 3.7 细菌学分类 |
| 3.8 药物敏感性试验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 不同治疗方法对犬伪中间葡萄球菌性角膜溃疡的疗效观察 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药品和试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 仪器和设备 |
| 1.5 手术器械 |
| 2 方法 |
| 2.1 造模前准备 |
| 2.2 麻醉与保定 |
| 2.3 术部消毒 |
| 2.4 角膜溃疡模型建立 |
| 2.5 手术治疗前准备 |
| 2.6 抗生素治疗组 |
| 2.7 抗生素联合手术治疗组 |
| 2.8 术后护理 |
| 3 术后临床常规检查及裂隙灯观察 |
| 3.1 临床检查 |
| 3.2 裂隙灯检查 |
| 3.3 治疗过程中犬泪液量检测 |
| 3.4 犬眼内压测定 |
| 4 统计分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 抗生素治疗组裂隙灯观察的变化 |
| 5.2 手术治疗组裂隙灯观察 |
| 5.3 临床评分 |
| 5.4 泪液量检测结果 |
| 5.5 眼内压检测结果 |
| 5.6 三种治疗方案的疗效 |
| 5.7 三种治疗方案的愈合时间 |
| 6 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 不同治疗方法对角膜溃疡模型犬角膜组织病理学与相关细胞因子表达的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试剂配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 实验动物分组 |
| 2.2 实验犬术前准备 |
| 2.3 手术采样 |
| 2.4 组织切片制作 |
| 2.5 荧光定量PCR检测相关基因表达量 |
| 2.6 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 组织病理学观察 |
| 3.1.1 抗生素治疗组组织病理学观察 |
| 3.1.2 抗生素联合手术治疗组病理学切片观察 |
| 3.2 qPCR检测角膜细胞因子的结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 带蒂板层角膜移植术对犬深层角膜溃疡临床病例的疗效观察 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 临床病例介绍 |
| 2 方法 |
| 2.1 术前临床检查 |
| 2.2 手术方法 |
| 2.3 术后护理 |
| 2.4 术后临床检查 |
| 3 结果 |
| 3.1 术前检查结果 |
| 3.2 术后检查结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 附录 |
（2）真菌性角膜炎患眼及对侧未感染眼泪液中炎性细胞因子及MMP-9的表达变化及其意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 研究设计 |
| 2.2 一般资料 |
| 2.2.1 研究对象及分组 |
| 2.2.2 真菌性角膜溃疡患者纳入标准 |
| 2.2.3 真菌性角膜溃疡患者排除标准 |
| 2.2.4 健康对照组纳入标准 |
| 2.3 主要仪器及器材 |
| 2.4 研究方法 |
| 2.4.1 泪液采集 |
| 2.4.2 ELISA检测 |
| 2.4.3 泪膜破裂时间 |
| 2.4.4 基础泪液分泌实验 |
| 2.4.5 角膜知觉检查 |
| 2.4.6 视觉模拟评分 |
| 2.5 统计学分析 |
| 第3章 结果分析 |
| 3.1 基本信息分析 |
| 3.2 ELISA检测结果分析 |
| 3.3 泪膜功能及角膜知觉分析 |
| 3.4 相关性分析 |
| 3.4.1 患眼泪液炎性细胞因子与角膜知觉及疼痛评分相关性 |
| 3.4.2 对侧未感染眼泪液炎性细胞因子与泪膜功能的相关性 |
| 3.4.3 正常健康对照组泪液炎性细胞因子与泪膜功能的相关性 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 不足之处与展望 |
| 6.1 不足之处 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 炎性细胞因子及基质金属蛋白酶在眼科相关疾病应用的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）吡柔比星通过诱导细胞凋亡和自噬抗兔结膜纤维化（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语及中英文对照 |
| 引言 |
| 第一部分 用角膜缘干细胞切除联合碱烧伤法在新西兰白兔眼中建立结膜纤维血管模型 |
| 1 前言 |
| 2 材料及方法 |
| 2.1 主要试剂及配置 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 动物实验 |
| 2.4 人翼状胬肉标本的采集 |
| 2.5 制备石蜡切片 |
| 2.6 HE染色 |
| 2.7 免疫组化染色 |
| 2.8 免疫荧光 |
| 2.9 阅片与数据分析 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 角膜缘干细胞切除联合碱烧伤法成功地诱导了新西兰白兔结膜纤维血管组织(conjunctival fibro-vascular tissue[CFVT])形成 |
| 3.2 兔结膜纤维血管组织具有与人复发胬肉相似的组织化学特征 |
| 3.3 术后观察 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 吡柔比星诱导体外培养原代兔结膜成纤维细胞凋亡和自噬 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂及配置 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 组织块法成功培养出原代兔结膜成纤维细胞 |
| 3.2 THP抑制RCF增殖,将细胞周期阻滞于G0/G1期 |
| 3.3 THP对 RCF侵袭及迁移能力的影响 |
| 3.4 THP诱导RCF死亡,激活线粒体介导的凋亡通路 |
| 3.5 THP诱导RCF自噬 |
| 3.6 THP抑制HCECs增殖,诱导其凋亡并将细胞阻滞于G2/M期 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 吡柔比星预防新西兰白兔结膜纤维血管组织切除术后复发 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂及配置 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 动物实验 |
| 2.4 制备石蜡切片 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 免疫组化染色 |
| 2.7 阅片分析 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 THP减少兔结膜纤维血管组织切除术后复发 |
| 3.2 THP诱导兔结膜发生自噬和凋亡 |
| 3.3 0.005 mg/mL THP未损伤手术周围角膜缘干细胞 |
| 3.4 THP对 C57BL/6 小鼠角膜上皮愈合功能的影响 |
| 3.5 THP对角膜﹑心脏﹑肝脏和肾脏的毒性评估 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 结膜术后纤维化机制及治疗 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
（4）脱细胞技术及其在眼表重建组织工程中的应用研究（论文提纲范文）
| 1 脱细胞支架制备方法 |
| 1.1 化学制备方法 |
| 1.1.1 表面活性剂 |
| 1.1.2 低渗溶液与高渗溶液 |
| 1.1.3 酸/碱溶液 |
| 1.1.4 醇类 |
| 1.2 物理制备方法 |
| 1.2.1 高静压技术 |
| 1.2.2 冻融法 |
| 1.3 生物制备方法 |
| 1.3.1 酶消化 |
| 1.3.2 非酶类 |
| 2 眼表组织脱细胞支架的制备 |
| 2.1 脱细胞角膜基质 |
| 2.1.1 化学与生物联合法 |
| 2.1.2 物理与化学/生物联合法 |
| 2.2 脱细胞组织工程结膜 |
| 3 问题与展望 |
（5）眼睑缺损修复中组织工程睑板替代材料的应用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 绪论 |
| 1 眼睑缺损和重建 |
| 1.1 眼睑的生物学特征 |
| 1.2 眼睑缺损的手术重建 |
| 2 眼睑重建替代材料的选择 |
| 2.1 自体组织材料 |
| 2.2 异体/异种组织材料 |
| 2.3 人工合成材料 |
| 3 组织工程在眼睑重建中的应用 |
| 3.1 组织工程睑板替代材料性能要求 |
| 3.2 材料介导宿主免疫反应 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 第一部分 新型支化聚乙烯多孔支架材料的制备及其生物相容性评估 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 B-PE材料理化特征和形貌结构 |
| 3.2 B-PE多孔支架形貌和结构 |
| 3.3 细胞毒性 |
| 3.4 细胞黏附与增殖 |
| 3.5 B-PE支架表面内皮细胞化 |
| 3.6 B-PE支架体内生物相容性组织学评估 |
| 3.7 B-PE多孔支架背埋相关基因表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 新型支化聚乙烯睑板材料应用于眼睑损伤修复的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 新鲜兔眼睑组织学与生物力学特征 |
| 3.2 B-PE多孔支架力学性能和微纳结构表征 |
| 3.3 兔睑板缺损修复大体观察 |
| 3.4 眼睑组织学修复效果评价 |
| 3.5 睑板缺损处纤维包裹评估 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 仿结膜-睑板双层复合支架的制备及其对眼睑损伤修复的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 双层支架宏观及微观形貌 |
| 3.2 双层支架力学性能 |
| 3.3 双层支架体外降解 |
| 3.4 细胞在支架中的增殖实验 |
| 3.5 CjECs在支架中形态和分布 |
| 3.6 双层支架在睑板-结膜缺损重建中的作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 生物材料在眼表微环境重建中的应用 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
（6）ATRA对TGF-β1诱导的HconF细胞纤维化作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 青光眼滤过性手术 |
| 2.2 TGF-β信号通路与结膜组织的创伤修复 |
| 2.3 全反维甲酸抗纤维化作用的研究进展 |
| 2.3.1 ATRA在纤维化疾病中的作用 |
| 2.3.2 ATRA对细胞外基质作用的信号通路的研究 |
| 2.4 PI3K/AKT信号通路与组织的纤维化 |
| 第3章 ATRA对TGF-β1诱导的HconF细胞纤维化的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 主要试剂的配置 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 用CCK-8 法检测ATRA对TGF-β1诱导的Hcon F细胞增殖的影响 |
| 3.2.4 用流式细胞仪检测ATRA对TGF-β1诱导的Hcon F细胞凋亡的影响 |
| 3.2.5 细胞划痕实验检测ATRA对TGF-β1诱导的Hcon F细胞迁移的影响 |
| 3.2.6 Transwell迁移实验检测ATRA对TGF-β1诱导的Hcon F细胞迁移的影响 |
| 3.2.7 Western blot法检测ATRA对Hcon F细胞collagen I、fibronectin、PI3K、p-PI3K、AKT、和p-Akt表达的影响 |
| 3.2.8 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 ATRA对TGF-β1诱导的Hcon F细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 ATRA对TGF-β1诱导的Hcon F细胞凋亡的影响 |
| 3.3.3 ATRA对TGF-β1诱导的Hcon F细胞ECM合成的影响 |
| 3.3.4 ATRA对TGF-β1诱导的Hcon F细胞迁移的影响 |
| 3.3.5 ATRA对TGF-β1诱导的Hcon F细胞PI3K/Akt信号通路表达的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 ATRA对兔眼小梁切除术后滤过道瘢痕化的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 术前及术后用ICARE眼压计记录双眼眼压值(mm Hg) |
| 4.2.2 眼前段照相 |
| 4.2.3 免疫组织化学法检测滤过泡结膜组织中α-SMA、FN、collagen-Ⅰ、Smad2/3、p-AKT/AKT及p-PI3K/PI3K的表达 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 PI3K抑制剂LY294002对TGF-β1诱导的HconF细胞外基质的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 用CCK-8 法检测PI3K抑制剂LY294002对TGF-β1诱导的Hcon Fs细胞增殖的影响 |
| 5.2.3 Transwell迁移实验检测PI3K抑制剂LY294002对TGF-β1诱导的Hcon Fs细胞迁移的影响 |
| 5.2.4 Western blot法检测PI3K抑制剂LY294002对TGF-β1诱导的Hcon Fs细胞collagen I、fibronectin表达的影响 |
| 5.2.5 统计学处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 PI3K抑制剂对TGF-β1诱导的Hcon Fs增殖的影响 |
| 5.3.2 抑制PI3K表达对TGF-β1诱导的HconF细胞迁移的影响 |
| 5.3.3 抑制PI3K表达对TGF-β1诱导的HconF细胞ECM合成的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 讨论 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）角膜缘干细胞标志物及其干性相关通路的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 角膜上皮的动态稳定 |
| 1.1.1 角膜的组织学结构和功能 |
| 1.1.2 X/Y/Z假说 |
| 1.2 LSCs及其niche |
| 1.2.1 LSCs的生物学特征 |
| 1.2.2 LSC niche的结构 |
| 1.2.3 LSCs niche的组成 |
| 1.3 LSCs标志物研究现状 |
| 1.3.1 细胞周期调控蛋白 |
| 1.3.2 ATP结合转运蛋白 |
| 1.3.3 细胞骨架蛋白 |
| 1.3.4 分化相关蛋白 |
| 1.4 LSCs的识别 |
| 1.4.1 LSCs标记物共表达 |
| 1.4.2 细胞核质比大于0.7(N/C≥0.7) |
| 1.4.3 标签滞留 |
| 1.4.4 侧群现象 |
| 1.5 LSCs特异性标志物研究的难点 |
| 1.5.1 角膜缘组织学的特殊性 |
| 1.5.2 酶消化的影响 |
| 1.5.3 缺乏理想的LSCs分离技术 |
| 1.5.4 LSCs的时间和空间分布的影响 |
| 1.6 新一代测序技术应用于LSCs标志物的研究 |
| 1.6.1 转录组测序在LSCs标志物的研究 |
| 1.6.2 蛋白质组测序在LSCs标志物的研究 |
| 1.7 本课题的来源与研究意义 |
| 1.8 本课题的研究思路及主要研究内容 |
| 第2章 小鼠角膜缘干细胞表达特点的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织收集 |
| 2.2.2 石蜡切片制备 |
| 2.2.3 HE染色 |
| 2.2.4 免疫组化染色 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小鼠眼球角膜的组织学结构 |
| 2.3.2 LSCs标志物在小鼠眼球表面的空间表达分布 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 2.4.1 小鼠LSCs具有独特的niche结构 |
| 2.4.2 4周龄小鼠LSCs的表达模式不同 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 小鼠角膜缘干细胞的基因表达与发育相关性的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂及耗材 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 组织收集 |
| 3.2.2 蜡切片制备 |
| 3.2.3 HE染色 |
| 3.2.4 免疫组化染色 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠眼角膜的发育 |
| 3.3.2 小鼠LSCs标志物的表达与发育相关 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.4.1 光刺激促进小鼠角膜上皮的发育 |
| 3.4.2 LSCs的表达具有时间特性 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 基于Illumina平台的小鼠角膜缘干细胞干性相关基因的转录组学研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂和耗材 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 组织收集 |
| 4.2.2 总RNA提取 |
| 4.2.3 文库制备以及Illumina Hiseq Xten测序 |
| 4.2.4 转录组学序列的分析 |
| 4.2.5 基因的表达以及功能分析 |
| 4.2.6 qRT-PCR |
| 4.2.7 免疫组化染色 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 转录组学测序概述 |
| 4.3.2 样品间基因表达相关性 |
| 4.3.3 DEGs的识别 |
| 4.3.4 DEGs的 GO分析 |
| 4.3.5 DEGs的 KEGG通路富集 |
| 4.3.6 DEGs的 qRT-PCR验证 |
| 4.3.7 细胞表面标志物的免疫组化染色 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.4.1 潜在的LSCs标志物表达的模式 |
| 4.4.2 在LSCs中富集到的与发育和细胞命运相关的GO条目 |
| 4.4.3 ECM相关的信号通路维持LSCs的表型 |
| 4.4.4 LSCs的基因表达模式与细胞间交流有关 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 基于Label-Free LC-MS/MS的小鼠的角膜缘干细胞标志物的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验试剂和耗材 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 组织收集 |
| 5.2.2 总蛋白提取和肽段酶解 |
| 5.2.3 质谱分析和LC-MS/MS数据采集 |
| 5.2.4 DEPs的生物信息学分析 |
| 5.2.5 免疫印迹检测(WB) |
| 5.2.6 免疫组化染色 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 质量控制以及鉴定蛋白质和肽段的特性 |
| 5.3.2 DEPs的识别 |
| 5.3.3 DEPs的 GO分析 |
| 5.3.4 DEPs的 KEGG通路富集 |
| 5.3.5 免疫组化染色检测候选LSCs标志物 |
| 5.3.6 DEPs的验证 |
| 5.4 分析与讨论 |
| 5.4.1 ALDH3B2、SLC5A8和HSD17B2 可作为候选LSCs标志物 |
| 5.4.2 细胞粘附蛋白维持LSCs表型及其niche细胞间的联系 |
| 5.4.3 Focal粘附信号通路调控LSCs增殖和自我更新 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 联合转录组学和蛋白质组学分析小鼠角膜缘干细胞干性相关通路 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 技术路线 |
| 6.2.2 关联数量及其表达量相关性统计分析 |
| 6.2.3 表达趋势相同的DEGs和 DEPs的生物信息学分析 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 关联数量统计 |
| 6.3.2 表达量相关性分析 |
| 6.3.3 关联到的表达趋势一致的DEPs的蛋白互作网络分析 |
| 6.3.4 关联到的表达趋势一致的DEPs的GO分析 |
| 6.3.5 关联到的表达趋势一致的DEPs的KEGG分析 |
| 6.4 分析与讨论 |
| 6.4.1 细胞外外泌体参与CECs-LSCs的交流 |
| 6.4.2 Focal粘附、ECM-受体相互作用和PI3K-AKT通路维持LSCs干性表型 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）溴芬酸钠抑制TGF-β1介导的人翼状胬肉成纤维细胞和人结膜成纤维细胞纤维化的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 主要仪器设备、材料与试剂 |
| 前言 |
| 第一部分 溴芬酸钠与TGF-β1对HPFs及HConFs细胞的作用 |
| 导言 |
| 第1节 原代HPFs和HConFs细胞的提取、培养及鉴定 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 原代HPFs和HConFs细胞的提取及培养 |
| 1.2 人包皮成纤维细胞（human foreskin fibroblasts, HFFs)及Hela细胞的培养 |
| 1.3 Western免疫印迹 |
| 1.4 细胞免疫荧光 |
| 2 结果 |
| 2.1 取材培养HPFs和HConFs来源的翼状胬肉病人及眼球捐赠者信息 |
| 2.2 对HPFs,HConFs,HConEs,HFFs,Hela五种细胞的形态鉴定 |
| 2.3 对HPFs,HConFs,HFFs,Hela四种细胞marker的western鉴定 |
| 2.4 对HPFs,HConFs,HFFs,Hela四种细胞marker的细胞免疫荧光鉴定 |
| 第2节 TGF-β1对HPFs和HConFs细胞的激活、细胞外基质表达的作用,以及对信号通路分子的影响 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 原代HPFs和HConFs细胞的处理 |
| 1.2 Western免疫印迹 |
| 1.3 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 TGF-β1对HPFs和HConFs细胞的FN,COL3和α-SMA蛋白表达的影响 |
| 2.2 TGF-β1对HPFs及HConFs细胞的p-AKT等信号分子的影响 |
| 第3节 溴芬酸钠对TGF-β1增强的HPFs及HConFs细胞的激活、细胞外基质表达、细胞迁移、细胞增殖的影响 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 处理细胞 |
| 1.2 Western免疫印迹 |
| 1.3 划线实验 |
| 1.4 CCK-8实验 |
| 1.5 细胞免疫荧光 |
| 1.6 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 溴芬酸钠对TGF-β1诱导的FN,COL3及α-SMA蛋白高表达的影响 |
| 2.2 溴芬酸钠对TGF-β1诱导的细胞迁移的影响 |
| 2.3 溴芬酸钠对TGF-β1诱导的细胞增殖的影响 |
| 第4节 溴芬酸钠对TGF-β1刺激的HPFs及HConFs细胞的信号分子的作用 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 处理细胞 |
| 1.2 Western免疫印迹 |
| 1.3 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 溴芬酸钠对TGF-β1诱导的p-AKT等细胞信号分子变化的影响 |
| 2.2 使用3种不同浓度溴芬酸钠对TGF-β1诱导的p-AKT等信号分子变化的影响 |
| 第5节 单用溴芬酸钠对HPFs及HConFs细胞的胞外基质等表达的作用,以及对信号通路分子的影响 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 处理细胞 |
| 1.2 Western免疫印迹 |
| 1.3 实时定量PCR (Quantitative real-time PCR) |
| 1.4 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 溴芬酸钠对FN,COL3,survivin,α-SMA及MMP3蛋白表达的影响 |
| 2.2 溴芬酸钠对FN,COL3,survivin,α-SMA及MMP3的mRNA表达的影响 |
| 2.3 溴芬酸钠对HPFs细胞中p-AKT等信号分子的影响 |
| 讨论 |
| 第二部分 AKT, ERK1/2和GSK-3β通路在TGF-β1诱导的HPFs及HConFs细胞的激活、细胞外基质表达中的作用 |
| 导言 |
| 第1节 AKT和ERK1/2通路参与TGF-β1诱导的HPFs及HConFs细胞的激活、细胞外基质表达 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 处理细胞 |
| 1.2 Western免疫印迹 |
| 1.3 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 各通路抑制剂对相应信号分子的影响 |
| 2.2 各通路抑制剂对FN,COL3和α-SMA蛋白表达的影响 |
| 第2节 GSK-3β通路参与TGF-β1诱导的HPFs及HConFs细胞的激活、细胞外基质表达 |
| 1 实验方法 |
| 1.1 处理细胞 |
| 1.2 Western免疫印迹 |
| 1.3 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 使用LiCl对TGF-β1诱导的相应分子的影响 |
| 2.2 使用SB216763对TGF-β1诱导的相应分子的影响 |
| 2.3 使用溴芬酸钠及LiCl对TGF-β1诱导的相应分子的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 课题创新与展望 |
| 补充材料 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及主要研究成果 |
（9）选择性半胱氨酰白三烯受体1（CysLT1R）拮抗剂孟鲁司特调节细胞外基质重塑（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 TGF-β1对CysLT受体1(CysLT1R)在HTFs中的表达的影响 |
| 材料及试剂 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 孟鲁司特对HTFs中TGF-β1诱导的细胞外基质(ECM)重塑的影响 |
| 材料和试剂 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（10）自制染色干燥细胞外基质胶羊膜生物学特性及修补结膜缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
四、结膜细胞外基质(ECM)的研究（论文参考文献）
- [1]102例犬细菌性角膜溃疡的流行病学调查及手术对深层角膜溃疡的疗效观察[D]. 张红超. 扬州大学, 2021
- [2]真菌性角膜炎患眼及对侧未感染眼泪液中炎性细胞因子及MMP-9的表达变化及其意义[D]. 章爽. 南昌大学, 2021(01)
- [3]吡柔比星通过诱导细胞凋亡和自噬抗兔结膜纤维化[D]. 徐丽娟. 浙江大学, 2020(01)
- [4]脱细胞技术及其在眼表重建组织工程中的应用研究[J]. 陈芳圆,周清. 医学综述, 2020(09)
- [5]眼睑缺损修复中组织工程睑板替代材料的应用研究[D]. 徐佩芳. 浙江大学, 2020(01)
- [6]ATRA对TGF-β1诱导的HconF细胞纤维化作用的研究[D]. 梁玲玲. 吉林大学, 2019(02)
- [7]角膜缘干细胞标志物及其干性相关通路的研究[D]. 郭志侯. 华侨大学, 2019(01)
- [8]溴芬酸钠抑制TGF-β1介导的人翼状胬肉成纤维细胞和人结膜成纤维细胞纤维化的研究[D]. 陈凯琳. 浙江大学, 2019(03)
- [9]选择性半胱氨酰白三烯受体1（CysLT1R）拮抗剂孟鲁司特调节细胞外基质重塑[D]. 彭婧利. 南方医科大学, 2018(01)
- [10]自制染色干燥细胞外基质胶羊膜生物学特性及修补结膜缺损的实验研究[J]. 江威,邹晶,邵毅,高桂平,李云燕,邓军萍,杨璐. 眼科新进展, 2015(08)