一、原位杂交法检测颗粒酶B在柯萨奇B3病毒性心肌炎小鼠心肌浸润细胞中的表达（论文文献综述）
汪亚萍[1]（2019）在《组织蛋白酶B在病毒性心肌炎中的作用及机制研究》文中认为研究背景:病毒性心肌炎是由病毒感染导致的心肌弥漫性或局灶性炎症病变。它是年轻人心源性猝死的重要原因之一,也是继发性扩张型心肌病的最常见病因,但目前临床上仍缺乏有效的特异性治疗措施。心肌细胞的凋亡、坏死和心脏中的炎症反应是病毒性心肌炎的主要病理特点。组织蛋白酶B（CatB）是一种广泛表达且主要位于溶酶体和晚期内体的半胱氨酸蛋白水解酶,可通过参与细胞凋亡、细胞外基质降解、抗原呈递、炎症反应、细胞自噬等多种病理生理过程从而参与多种疾病的发生和发展。然而,其在病毒性心肌炎中的作用尚无研究。因此,本研究旨在探索CatB在柯萨奇病毒B组3型（CVB3）诱导的小鼠病毒性心肌炎中的作用及相关机制。研究方法:本研究采用4周龄雄性CatB基因全敲（Ctsb-/-）小鼠、其内源性抑制剂胱抑素C（cystatin C）基因全敲（Cstc-/-）小鼠和野生型C57BL/6小鼠,通过腹腔注射1000半数组织培养感染剂量（TCID50）的CVB3构建小鼠病毒性心肌炎模型,应用心脏超声检查评价小鼠心功能后,收集其血清和心脏组织标本。通过苏木素-伊红染色、组织病理学评分、心脏超声、酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法,观察CatB敲除和cystatinC敲除对小鼠病毒性心肌炎生存率和疾病严重程度的影响;并进一步应用western blot蛋白印迹、酶活性测定、ELISA、原位末端转移酶标记技术（TUNEL）、病毒滴度测定等方法,探究CatB影响病毒性心肌炎的可能机制。研究结果:在感染CVB3后第7天和第28天,模型组小鼠心肌中活化型CatB的蛋白水平以及CatB的酶活性相比于对照组均明显升高。在未感染病毒的情况下,CatB及其内源性抑制剂cystatin C的缺失均不影响小鼠短期内的存活率、心脏结构和功能。但在腹腔接种等量CVB3的条件下,与野生型小鼠相比,Ctsb-/-小鼠的存活率、心肌组织炎症浸润、炎症病理评分、血清肌钙蛋白水平、心功能均明显改善,而Cstc-/-小鼠的这些指标均进一步恶化。进一步研究发现,野生型小鼠感染病毒后,心肌组织中炎症小体被激活,细胞焦亡加重,表现为含pyrin结构域的NOD样受体家族3（NLRP3）、含半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活和募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶caspase-1 p20片段表达增高、caspase-1酶活性增强、血清白介素-1β水平增高以及心肌组织TUNEL染色阳性细胞比例增加,而CatB的敲除抑制了心肌炎小鼠心肌中NLRP3炎症小体的激活和细胞焦亡,相反,cystatin C的敲除则进一步增强了该现象。但三种不同基因型小鼠感染CVB3后第7天和第28天,其心肌组织中的病毒滴度均无显着性差异。结论:在CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎模型中,心肌组织CatB被激活。CatB的激活会加重病毒性心肌炎,且这一作用不依赖于对病毒复制的影响,而调控NLRP3炎症小体的激活和促进细胞焦亡的发生可能是其作用机制之一。这为病毒性心肌炎提供了一个新的潜在治疗靶点,有望改善心肌炎的预后。
魏露观[2]（2013）在《影响细胞毒性T淋巴细胞在病毒性心肌炎中分布的相关研究》文中研究表明病毒性心肌炎（viral myocarditis,VMC）是由病毒感染心肌所致的以炎症病变为主的疾病。本病的临床表现差异很大，可从无症状到急性心力衰竭，猝死等。近年来，病毒性心肌炎在儿童、青少年中的发病率有逐年上升的趋势，已成为儿童、青少年猝死的重要原因之一。因此，对病毒性心肌炎的研究引起人们普遍关注。目前国内外关于VMC的诊断主要靠Dallas标准，但对于界限性心肌炎鉴别的不确定性及部分正常心肌组织中出现的单个或局灶炎细胞浸润，使得对一些镜下心肌纤维病变不明显、炎细胞浸润较少的猝死案例难以作出准确判断，这给这些案例的死因鉴定带来了一定困难。因此，寻找一种简便且有效的检测方法用于心肌炎的诊断以明确死因成为法医病理学的一个亟需解决的问题。迄今为止，VMC的发病机制尚不清楚，关于病毒性心肌炎的相关研究表明，细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）介导的细胞毒作用对心肌细胞的破坏已成为心肌损伤致急性心力衰竭的主要原因。近来有研究表明一些细胞因子在CTL的活化增殖及向病变区域迁移的过程中起重要作用。相关研究发现，骨桥蛋白（osteopontin,OPN）的异常表达参与了部分心血管疾病的病理进程，OPN表达的增强可引起T细胞的增殖活化并介导其的趋化迁移，造成严重的心肌损伤，导致心功能衰竭。另外，最近有国外研究表明，基质金属蛋白酶-2（matrixmetalloproteinases,MMP-2）在疾病中不仅可造成正常心肌胶原过度降解，使心肌胶原重构，引起心肌纤维化，还可作为一种有力的调节因子促进免疫细胞的迁移，加重病变的发展。而尿激酶型纤溶酶原激活因子（urokinase type plasminogenactivator, uPA）作为MMP-2的激活因子除了可通过间接的刺激MMP的活化参与病变进程还可直接调节免疫细胞的表达，从而促进VMC的发生与发展。但是，对于病毒性心肌炎猝死者心肌组织中的OPN、uPA、MMP-2的相关表达及其对CTL的影响，目前尚未十分清楚。目的：本次实验通过免疫组化方法检测OPN、uPA、MMP-2、CD8在人正常心肌和心肌炎组织的表达，探讨OPN、uPA、MMP-2与CD8+T细胞的关系和在心肌炎进展中的相互关系，为心肌炎猝死的病理学诊断、死因分析提供简便、可行的监测手段和依据。方法：收集大连医科大学病理学与法医学教研室尸检心肌炎病例存档蜡块共计40例，男27例，女13例，年龄在6-72岁。实验根据Dallas标准分为明确性心肌炎组（14例）和界限性心肌炎组（11例）及正常心肌组（15例）。采用免疫组化方法检测OPN、uPA、MMP-2、CD8在三组心肌组织的表达情况，并对结果进行统计学分析。结果：1、OPN、uPA、MMP-2三者在正常心肌不表达或弱表达，在界限性心肌炎和明确性心肌炎呈阳性和强阳性表达，主要表达在心肌细胞、炎细胞（主要是巨噬细胞、淋巴细胞）的胞浆。OPN、uPA、MMP-2在三组的表达均存在差异，具有统计学意义（P＜0.05）。2、CD8在正常心肌不表达，在心肌炎组表达升高，且在界限性心肌炎组和明确性心肌炎组的表达存在差异（P＜0.05）。3、采用Spearman等级相关检验分析发现OPN、uPA、MMP-2、CD8在心肌炎组的表达呈显着正相关。结论：1、在正常心肌组织中无CD8的表达，在心肌炎时细胞数量增多，提示CD8+T细胞在心肌炎时浸润增加，参与心肌细胞损伤过程并作用于心肌炎的进展。2、OPN、uPA、MMP-2在正常心肌少量表达，在心肌炎发生后表达显着升高，三者的表达呈正相关，且与CD8的表达有显着相关性，提示心肌炎时OPN可促进uPA、MMP-2的异常表达，且三者协同促进CD8+T细胞的活化及向病变区域的趋化、迁移。
单玉[3]（2010）在《苦参、黄芪药对配伍对病毒性心肌炎的治疗作用及机制研究》文中研究指明目的:探讨研究苦参、黄芪药对以苦参中槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、黄芪中黄芪甲苷和以增强小鼠免疫功能为指标确定最佳提取方法和最佳配伍比例;研究苦参、黄芪药对配伍后对苦参中氧化苦参碱、氧化槐果碱在大鼠体内血药浓度影响;苦参、黄芪及苦参、黄芪药对提取物体外抗CVB3病毒及体外对感染CVB3病毒SD大鼠心肌细胞的保护对比实验研究;研究苦参、黄芪药对提取物对CVB3诱导Balb/c小鼠心肌炎的治疗作用;研究苦参、黄芪药对提取物对CVB3诱导Balb/c小鼠心肌炎治疗的可能机制。材料与方法:1、苦参、黄芪药对的最佳提取方法、比例的确定:苦参、黄芪药对用水分提合并、水合提取、醇分提合并、醇合提取四种提取方法,苦参、黄芪药对按生药量比例1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、3:1、4:1、5:1混合,通过紫外分光光度法测定总生物碱、高效液相色谱法测定苦参中槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱、黄芪中黄芪甲苷指标性成分和增强小鼠免疫功能影响的药效研究,确定了苦参、黄芪药对最佳提取方法、最佳配伍比例。2、苦参、黄芪药对提取物、单味药苦参提取物中氧化苦参碱、氧化槐果碱在大鼠血浆中的药代动力学研究:分别取健康大鼠6只,雌、雄各半,取空白血浆0.5 mL后,分别灌胃给药（黄芪、苦参药对提取物和苦参提取物）,于给药后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h,各从大鼠眼眶后静脉丛取血0.5 mL,进行血浆内苦参、黄芪药对提取物、苦参提取物中有效成分氧化苦参碱、氧化槐果碱的药代动力学分析。3、苦参、黄芪及苦参、黄芪药对提取物体外抗CVB3病毒及体外对感染CVB3病毒SD大鼠心肌细胞的保护对比实验研究:在体外CVB3病毒感染的培养心肌细胞模型成功建立的基础上,分病毒对照组、正常细胞对照组、阳性对照药干扰素组,苦参提取物高、中、低剂量组,黄芪提取物高、中、低剂量组,苦参、黄芪药对提取物高、中、低剂量组,分别于第2、5d时间点,在倒置显微镜下测定每孔细胞搏动速率,并进行形态学观察,吸取上清液测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的含量和测定药物抑制病毒滴度。4、苦参、黄芪药对提取物对CVB3感染的Balb/c小鼠心肌炎治疗作用实验研究:纯系雄性Balb/c小鼠,4周龄（体重为12g左右）,设苦参、黄芪药对提取物高、中、低剂量组,另外设三个对照组:空白对照组、病毒对照组、玉丹荣心丸阳性对照组,每组二十只小鼠,统计小鼠死亡率,分别在第7d、14d无菌条件下取心脏,用HE染色方法观察小鼠心肌损伤、测定心肌病毒滴度。5、苦参、黄芪药对提取物对CVB3感染的Balb/C小鼠心肌炎治疗作用机制研究:纯系雄性Balb/c小鼠,4周龄（体重为12g左右）,设苦参、黄芪药对提取物高、中、低剂量组,另外设三个对照组:空白对照组、病毒对照组、玉丹荣心丸阳性对照组,给药14d后通过免疫组化、原位杂交方法和原位末端标记法对组织进行凋亡形态学分析,观察心肌颗粒酶B的蛋白、BCL-2基因表达,Caspase3的蛋白、基因表达,及心肌细胞凋亡情况,探索苦参、黄芪药对提取物治疗CVB3感染心肌炎的可能机制。结果:1.苦参、黄芪药对的最佳提取方法、最佳配伍比例的确定苦参、黄芪药对经乙醇合提取,用高效液相色谱法测定苦参中槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱五种生物碱的含量最高,分别为1.0128、2.9458、1.0803、0.71790、3.0960mg·g-1,黄芪甲苷含量0.11920mg·g-1,用分光光度法总生物碱含量3.1880 mg·g-1,通过对小鼠免疫功能影响的研究,苦参、黄芪药对经乙醇合提对小鼠免疫功能影响明显优于与其它提取方法对小鼠的免疫功能影响。苦参、黄芪药对4:1配伍用高效液相色谱法测定苦参中槐果碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、氧化苦参碱5种生物碱的含量较高高,分别为3.9020、10.740、2.4293、2.2400、6.9530mg·g-1,苦参、黄芪2:1配伍黄芪甲苷含量最高为0.13060mg·g-1,用分光光度法测总生物碱苦参、黄芪5:1配伍含量最高为3.4740 mg·g-1,通过对小鼠免疫功能影响的研究,苦参、黄芪药对2:1配伍比例对小鼠免疫功能影响明显优于与其它配伍比例对小鼠的免疫功能影响。在中药配伍的运用中,我们不仅要考虑单味药物的剂量,更要注意药物用量之间的比例。通过配伍,既能增强原药物的作用,更能调和偏性,取长补短,发挥药物配伍的长处,使各具特征的药物形成一个新的有机整体,以适应复杂病症的治疗需要。在本实验中,以中医药基础理论为指导依据,以药理疗效结果为主要依据,有效成分含量为辅助指标,最终确定苦参、黄芪按生药量配伍的最佳比例为2:1。2、苦参、黄芪药对提取物、单味药苦参提取物中氧化苦参碱、氧化槐果碱在大鼠血浆中的药代动力学研究大鼠灌胃苦参、黄芪药对提取物后的氧化苦参碱在大鼠体内的最大血药浓度为2.010μg·mL-1,达峰时间为6小时,药物分子在体内0-24小时的平均停留时间为12.91小时, 0-24小时药时曲线下面积为22.61mg/L*h;苦参药材中的氧化苦参碱在大鼠体内的最大血药浓度为6.526μg·mL-1,达峰时间为4小时,药物分子在体内0-24小时的平均停留时间为15.70小时,0-24小时药时曲线下面积为46.50mg/L*h。将药对提取物和苦参药材提取物处理结果相比较,可得知,黄芪、苦参药对配伍后达峰时间有所延后,除MRT（药物分子在大鼠体内的平均停留时间）较苦参药材提取物大,其余统计据参数均小于苦参药材提取物。大鼠灌胃苦参、黄芪药对提取物后的氧化槐果碱在大鼠体内的最大血药浓度为3.954μg·mL-1,达峰时间为6小时,药物分子在体内0-24小时的平均停留时间为8.679小时, 0-24小时药时曲线下面积为43.31mg/L*h;苦参药材中的氧化槐果碱在大鼠体内的最大血药浓度为2.202μg·mL-1,达峰时间为4小时,药物分子在体内0-24小时的平均停留时间为9.385小时, 0-24小时药时曲线下面积为26.11mg/L*h。从统计据参数结果分析,给苦参药材的血药达峰时间为4小时,而给药对的为6小时,苦参药材明显比药对的时间短,一般会认为苦参中的氧化槐果碱吸收的较快,更易被大鼠吸收,但是从大鼠体内的最大血药浓度分析,给苦参的血药最大浓度为2.202μg·mL-1,而给药对的则是3.954μg·mL-1,药对明显高于苦参,说明药对中的氧化槐果碱比较容易被大鼠吸收。此外从AUC（药时曲线下峰面积）来看,苦参、黄芪药对明显高于苦参药材,认为苦参、黄芪药对提取物能促进氧化槐果碱的吸收。3、苦参、黄芪及苦参、黄芪药对提取物体外抗CVB3病毒及体外对感染CVB3病毒SD大鼠心肌细胞的保护对比实验研究在第2d时,苦参提取物高剂量组,苦参、黄芪药对提取物高、中剂量组与病毒对照组有显着性差异（P<0.05）,但是苦芪的高、中剂量组与苦参高剂量组没有显着性差异（P>0.05）,但在第5d天时,苦参高、中剂量组和苦参、黄芪药对提取物高、中、低剂量组与病毒对照组有显着性差异（P<0.05）,并且苦参、黄芪药对提取物高、中剂量组与苦参高、中剂量组有显着性差异（P<0.05）4、苦参、黄芪药对提取物对CVB3感染的Balb/C小鼠心肌炎治疗作用实验研究通过死亡率统计、病毒滴定分析、病理切片结果分析在7d时,只有高剂量苦参、黄芪药对提取物组有降低死亡率、对病毒的有抑制及保护心肌作用。在第14d时苦参、黄芪药对提取物高、中、低均能对病毒的有抑制及保护心肌作用,并且有良好的剂量-效用关系。5、苦参、黄芪药对提取物对CVB3感染的Balb/C小鼠心肌炎治疗作用机制研究给药14d后通过免疫组化、原位杂交方法和原位末端标记法对心肌组织进行凋亡形态学分析,苦参、黄芪药对提取物能够降低心肌颗粒酶B的蛋白、Caspase3的蛋白、基因及心肌细胞凋亡情况表达,上调BCL-2基因表达,苦参、黄芪药对提取物的高、中、低剂量对蛋白、基因表达水平有显着性差异。结论:1、苦参、黄芪药对最佳提取方法为乙醇合提取,最佳配伍比例为2:1。2、苦参、黄芪药对提取物中黄芪能够促进苦参中氧化槐果碱吸收,促进氧化苦参碱转化为苦参碱而被吸收。3、苦参、黄芪药对提取物对CVB3感染的心肌细胞的保护及抗病毒作用优于单味药苦参、黄芪。4、苦参、黄芪药对提取物对CVB3感染的Balb/c小鼠心肌炎有治疗作用。5、苦参、黄芪药对提取物可能是通过降低心肌颗粒酶B的蛋白、Caspase3的蛋白、基因表达,及心肌细胞凋亡情况表达,上调BCL-2基因表达而对病毒性心肌炎起到一定的治疗作用。
叶春华,程志清[4]（2009）在《实验性病毒性心肌炎心肌颗粒酶B表达的研究》文中研究指明目的探讨颗粒酶B（GzmB）在病毒性心肌炎（VMC）心肌损伤过程中的作用及其发病机制。方法将36只5～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分成两组:正常组10只,模型组26只。于第11天处死小鼠取出心脏观察心肌病变,并以半定量RT-PCR和免疫组化方法检测心肌GzmB的表达。结果模型组小鼠心肌组织中均检测到GzmB阳性细胞和GzmB mRNA的表达,且小鼠心肌浸润细胞中GzmB阳性细胞数与心肌病理积分呈显着正相关（r=0.859,P=0.000）,而正常组小鼠心肌中未检测到GzmB的表达。结论心肌浸润细胞中GzmB的表达在病毒性心肌炎心肌损伤中起一定作用,其介导的细胞毒效应是导致病毒性心肌炎心肌损伤的重要机制之一;心肌浸润细胞中GzmB的表达量与心肌损害严重程度成显着正相关。
叶春华,程志清[5]（2009）在《病毒性心肌炎心肌颗粒酶B表达的实验研究》文中研究说明目的探讨颗粒酶B在柯萨奇病毒B组病毒介导的病毒性心肌炎心肌病变及发病机制中的作用。方法将36只5周～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分成两组:正常组10只,模型组26只。模型组以病毒液0.1mL腹腔注射建立模型,正常组予0.1mL不含病毒的Eagle′s基本必需培养基液腹腔注射。于第11d处死小鼠取出心脏,分别在肉眼下、光镜下和电镜下观察心肌的病变并计分;以半定量逆转录酶聚合酶链反应和免疫组化方法检测心肌颗粒酶B的表达。结果模型组心肌大体病变计分显着高于正常组,差异有统计学意义[（3.2±1.6）分vs.（0.2±0.1）分,P<0.01]。光镜下模型组心肌病理计分显着高于正常组,差异有统计学意义[（8.4±4.5）分vs.（0.3±0.1）分,P<0.01]。电镜下模型组心肌细胞超微结构损害严重,正常组心肌细胞超微结构均正常。免疫组化显示模型组每高倍视野颗粒酶B阳性细胞数显着高于正常组,差异有统计学意义[（2.7±1.1）个vs.（0.0±0.0）个,P<0.01]。直线相关与回归分析表明,模型组小鼠心肌浸润细胞颗粒酶B阳性细胞数与心肌病理计分呈显着正相关（r=0.859,P<0.01）。逆转录酶聚合酶链反应产物电泳条带的半定量分析表明,模型组心肌颗粒酶B扩增产物产量高,而正常组无颗粒酶B表达。结论心肌浸润细胞中颗粒酶B的表达在病毒性心肌炎心肌损伤中起一定作用,其表达水平与心肌病理损害严重程度一致。
翟莉,杨艳敏[6]（2009）在《病毒性心肌炎免疫机制研究进展》文中研究说明病毒感染诱发的免疫反应与病毒性心肌炎的组织损伤有着密切的联系,近年来对免疫发病机制的研究主要有以下几个方面:细胞免疫介导的心肌损伤、自身免疫造成的心肌损伤以及细胞因子的共同作用。
盖显英[7]（2009）在《利用BALB/C小鼠及其原代培养心肌细胞研究川金丝猴源CVB3的致病性》文中研究表明柯萨奇病毒（Coxsackievirus,CV）属于小RNA病毒科,肠道病毒属的成员,自1948年发现以来,在人群中的感染普遍存在,是近年来引起关注的人类病毒性心肌炎的一种主要病原之一,而且在国内外人群中的发病呈上升趋势。CV可分为A、B两个型,即CVA和CVB,其中,CVB又有6个血清型（CVB1CVB6）。除人类外,CVB还可感染猩猩和比格犬等动物,并导致死亡。2005年,本课题组对临床死亡的金丝猴进行系统的诊断,证实其死于CVB3感染,这是国内外首次有该病原感染金丝猴死亡的报道。多数资料报道CVB3具有嗜心肌性,主要侵犯心肌并造成其损伤,但是,有的毒株还可导致胰腺、肾脏、神经以及子宫等组织器官损伤,也有部分毒株甚至没有致病性。由此可见,不同的分离毒株感染后其致病性不尽相同。为了明确川金丝猴源CVB3（CVB3/SGM-05）这一新分离毒株的致病特性,本研究以BALB/C小鼠为实验动物,开展相关的致病性研究。本研究以新生BALB/C小鼠的心脏为材料,分离培养其心肌细胞,经形态学观察及其心肌生长特性鉴定,确定已成功建立了一种原代心肌细胞培养方法。为研究具有嗜心肌性病毒的致病机制研究提供良好的实验体系。将CVB3/SGM-05毒株接种原代培养的小鼠心肌细胞,染毒细胞出现明显的细胞病变,而且失去心肌细胞特有的节律收缩现象。将该染毒细胞制作超薄切片后电镜观察发现,在胞浆内有大量的CVB3病毒粒子形成的晶格状结构,说明该病毒可感染原代培养的小鼠心肌细胞,并可在其中进行大量的复制,初步明确CVB3/SGM-05毒株对原代心肌细胞的超微病变。将CVB3/SGM-05毒株通过腹腔注射途径接种健康的BALB/C小鼠后,观察该病毒对小鼠的致病性。小鼠于接毒后60h开始死亡,发病小鼠均出现典型的结膜炎,死亡率高达80%以上。对死亡小鼠剖检可见:最明显的病变为腹腔内脂肪的大量坏死;肝脏明显肿大,表面可见针尖大灰白小点;部分小鼠的脾脏肿大、边缘与坏死的脂肪发生粘连。石蜡病理组织切片显示,脂肪坏死尤其明显;心、肝、肾等实质器官均有不同程度的细胞变性,肝细胞坏死严重;脑组织可见轻度淤血;胃、肠黏膜上皮坏死、脱落。说明CVB3分离毒株感染BALB/C可引起多脏器的损伤。对死亡小鼠的心肌制作组织超薄切片,电镜观察显示,无明显的病变。将接种CVB3/SGM-05毒株的BALB/C小鼠于不同时间采集血液,分离血清后检测其中的心肌酶、肝功、肾功、血糖以及胰淀粉酶的变化。结果显示,血清中被检的酶类随着病程的发展呈现出一定的变化特点,如心肌酶CK于接毒后第2天即升高到正常值的2倍左右,7天后可达到3倍以上,之后呈逐渐下降趋势;而HBD于接毒后第2天即升高到正常值的4倍以上,以后逐渐下降。小鼠肝功能相关酶类变化不显着。肾功能相关的BUN无显着变化等。这些检测结果与CVB3标准毒株感染BALB/C小鼠后的血清酶学指标存在一定的差异,提示临床诊断CVB3感染时,除酶学指标外应综合分析。该项研究从细胞病理、组织病理及血液病理等多个方面研究了CVB3/SGM-05毒株对BALB/C小鼠的致病特性,不仅为CVB3感染的临床综合诊断提供一定的参考,而且为下一步建立CVB3/SGM-05毒株感染的实验动物模型奠定了坚实的基础。
郭春艳,韩波[8]（2008）在《颗粒酶B在病毒性心肌炎发病机制中作用的研究》文中进行了进一步梳理细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）介导的细胞毒性作用被认为是病毒性心肌炎（viral myocarditis,VMC）中心肌细胞损伤的主要机制之一。CTL通过穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒途径、Fas/FasL诱导的细胞凋亡途径及细胞因子介导途径
朴圣爱[9]（2008）在《羚桂龙牡颗粒对病毒性心肌炎模型小鼠作用机制的研究》文中提出目的:通过观察羚桂龙牡颗粒对病毒性心肌炎模型小鼠的影响,从病理形态及超微结构的改变、ERK1/2的表达、T细胞亚群的变化三个方面探讨其作用机制,为临床治疗和预防小儿病毒性心肌炎提供理论依据。方法:采用Balb/c小鼠腹腔注射柯萨奇B3m病毒的方式,建立病毒性心肌炎动物模型。120只Balb/c小鼠随机分为3组:模型组（n=40）治疗组（n=40）正常组（n=40）。于治疗后7、14、21天用光镜、电镜观测小鼠心肌病理形态及超微结构的改变;治疗后3天、7天用免疫组化法测定心肌细胞中ERK1/2的表达;7天、21天采用流式细胞仪检测外周血CD4+T、CD8+T细胞含量,计算CD4+/CD8+的比值。结果:1.治疗组的病理形态改变明显较模型组轻微。2.与正常组比较,模型组心肌组织ERK1/2表达均明显升高;与模型组相比,治疗组心肌组织ERK1/2表达明显降低（P＜0.01）。3.与正常组比较,7天模型组CD4+细胞含量明显降低（P＜0.01）,CD8+细胞含量明显升高（P＜0.01）,CD4+/CD8+明显降低（P＜0.01）;与7天模型组相比,7天治疗组CD4+细胞含量明显升高（P＜0.01）,CD8+细胞含量明显下降（P＜0.05）,CD4+/CD8+比值回升（P＜0.01）;7天治疗组与正常组相比无显着差异（P＞0.05）。与正常组比较,21天模型组CD8+细胞含量明显降低（P＜0.01）,CD4+/CD8+明显升高（P＜0.01）;与21天模型组相比,21天治疗组CD8+细胞含量明显回升（P＜0.01）,CD4+/CD8+比值下降（P＜0.01）;21天治疗组与正常组相比无显着差异（P＞0.05）。结论:1.羚桂龙牡颗粒可减轻病毒性心肌炎小鼠心肌病理形态及超微结构的病变。2.羚桂龙牡颗粒可抑制细胞外信号激酶1和2的表达,从而有效控制病毒的复制和免疫杀伤系统及细胞凋亡的激活对心肌的损伤。3.羚桂龙牡颗粒能调节辅助性和杀伤性T淋巴细胞而控制细胞介导的自身免疫损伤。
吴凤兰[10]（2008）在《益气养阴、活血化瘀方对病毒性心肌疾病小鼠心肌穿孔素和颗粒酶B影响的研究》文中提出目的:观察中药益气养阴、活血化瘀方对实验性病毒性心肌疾病模型小鼠心肌穿孔素和颗粒酶B表达的影响,为今后治疗病毒性心肌疾病提供客观理论依据。方法:采用多次腹腔注射CVB3m病毒的方法,建立反复感染的病毒性心肌疾病小鼠模型。将210只Balb/c小鼠随机分为4组,空白对照组为30只,模型对照组、中药高剂量组、中药低剂量组,每组各为60只。采用常规方法观察各组小鼠心脏质量指数的变化;采用HE、VG染色法观察各组小鼠心肌病理形态及超微结构的变化;采用RT-PCR法观察各组小鼠心肌穿孔素和颗粒酶BmRNA的表达水平的变化。结果:1.益气养阴、活血化瘀方能明显降低病毒性心肌疾病模型小鼠心脏质量指数,以高剂量组效果为佳。2.益气养阴、活血化瘀方能明显改善病毒性心肌疾病模型小鼠心肌病理形态及超微结构的变化,从而减轻其心肌病理损伤,以高剂量组效果为佳。3.益气养阴、活血化瘀方能下调病毒性心肌疾病模型小鼠心肌组织穿孔素和颗粒酶B mRNA的表达水平,以高剂量组效果为佳。结论:1.益气养阴、活血化瘀方对病毒性心肌疾病模型小鼠有明显的治疗作用。2.益气养阴、活血化瘀方能下调病毒性心肌疾病模型小鼠心肌组织穿孔素和颗粒酶BmRNA的表达水平,这可能是其治疗病毒性心肌疾病的作用机制之一。
二、原位杂交法检测颗粒酶B在柯萨奇B3病毒性心肌炎小鼠心肌浸润细胞中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、原位杂交法检测颗粒酶B在柯萨奇B3病毒性心肌炎小鼠心肌浸润细胞中的表达（论文提纲范文）
（1）组织蛋白酶B在病毒性心肌炎中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 HeLa细胞和病毒 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 CVB3病毒的扩增和滴度测定 |
| 3.2 基因敲除小鼠的鉴定 |
| 3.3 小鼠病毒性心肌炎的建立 |
| 3.4 小鼠心脏超声检查 |
| 3.5 小鼠组织标本的收集 |
| 3.6 心肌组织病理学检测 |
| 3.7 心脏组织病毒滴度测定 |
| 3.8 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 3.9 Western blot蛋白印迹 |
| 3.10 Caspase-1酶活性测定 |
| 3.11 CatB酶活性测定 |
| 3.12 原位末端转移酶标记(TUNEL)技术 |
| 3.13 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎模型的构建 |
| 4.2 病毒性心肌炎小鼠心肌中CatB被激活 |
| 4.3 Ctsb~(-/-)小鼠和Cstc~(-/-)小鼠基因敲除的验证 |
| 4.4 CatB和cystatinC敲除不影响小鼠短期内的存活率、心脏结构和功能 |
| 4.5 CatB加重CVB3诱导的心肌细胞损伤和心功能不全 |
| 4.6 CatB在小鼠病毒性心肌炎中的作用并非通过影响病毒复制而实现 |
| 4.7 CatB促进了病毒性心肌炎小鼠心肌中NLRP3炎症小体的激活 |
| 4.8 CatB促进了病毒性心肌炎小鼠心肌组织中细胞焦亡的发生 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（2）影响细胞毒性T淋巴细胞在病毒性心肌炎中分布的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 标本来源 |
| 2. 试剂和仪器 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 组织学检测 |
| 3.2 分组 |
| 3.3 免疫组化检测 |
| 4. 结果判定 |
| 4.1 结果判断标准 |
| 4.2 统计学分析方法 |
| 结果 |
| 1. 光镜下形态学观察 |
| 2. 免疫组化实验结果 |
| 2.1 OPN 蛋白在各组的表达 |
| 2.2 uPA 蛋白在各组的表达 |
| 2.3 MMP-2 蛋白在各组的表达 |
| 2.4 CD8 的表达 |
| 2.5 OPN、uPA、MMP-2、CD8 表达的相关性分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）苦参、黄芪药对配伍对病毒性心肌炎的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照及缩略词表 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第一部分 苦参、黄芪药对制备方法及质量标准研究 |
| 一、苦参、黄芪药对最佳提取方法的确定 |
| （一） 苦参、黄芪药对中苦参、黄芪薄层色谱鉴别 |
| （二） 紫外分光光度法测定不同提取方法苦参、黄芪药对总生物碱含量 |
| （三） HPLC 法测定苦参、黄芪药对中指标性成分的含量 |
| （四） 苦参、黄芪药对不同提取方法对小鼠免疫功能影响的研究 |
| 二、苦参、黄芪药对最佳配伍比例的确定 |
| （一） 苦参、黄芪药对中苦参、黄芪的薄层色谱鉴别 |
| （二） 紫外分光光度法测定总生物碱含量 |
| （三） HPLC 法测定指标性成分的含量 |
| （四） 药效学实验 |
| 三、苦参、黄芪提取物制备工艺研究 |
| 四、苦参、黄芪药对提取物质量标准研究 |
| （一） 苦参、黄芪药对提取中苦参、黄芪薄层色谱的鉴别 |
| （二） 苦参、黄芪药对提取物含量测定 |
| 第二部分 苦参、黄芪药对提取物中氧化苦参碱、氧化槐果碱在大鼠血浆中的药代动力学研究 |
| 一、苦参、黄芪药对和苦参提取物中氧化苦参碱在大鼠血浆中的药代动力学研究 |
| 二、苦参、黄芪药对提取物中氧化槐果碱在大鼠血浆中的药代动力学研究 |
| 第三部分 苦参、黄芪药对提取物体外抗 CVB3及体外对感 染 CVB3的 SD 大鼠心肌细胞保护实验研究 |
| 一、药物对细胞的毒性及病毒 TCID50的测定 |
| 二、苦参、黄芪及苦参、黄芪药对提取物体外抗 CVB3病毒及体外对感染 CVB_3病毒 SD 大鼠心肌细胞的保护对比实验研究 |
| 第四部分 黄芪、苦参药对提取物对 CVB_3 感染的 Balb/c 小鼠心肌炎的治疗作用 |
| 一、CVB_3病毒小鼠体内 TD_(50)测定 |
| 二、苦参、黄芪药对提取物急毒实验研究 |
| 三、病毒性心肌炎动物模型建立及鉴定 |
| 四、苦芪提取物对 CVB3 感染的 Balb/C 小鼠心肌炎治疗作用实验研究 |
| 第五部分 黄芪、苦参药对提取物对小鼠感染 CVB_3 病毒性心肌炎凋亡及其相关基因的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）病毒性心肌炎心肌颗粒酶B表达的实验研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 动物 |
| 1.1.2 病毒 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物分组 |
| 1.2.2 动物模型建立方法 |
| 1.2.3 心肌大体病变计分 |
| 1.2.4 光镜观察心肌病理改变计分 |
| 1.2.5 免疫组化检测心肌浸润细胞颗粒酶B |
| 1.2.6 电镜观察心肌病理改变 |
| 1.2.7 半定量逆转录酶聚合酶链反应检测 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 两组心脏大体病变比较 |
| 2.2 两组光镜下心肌病理改变比较 |
| 2.3 两组电镜下心肌病理改变比较 |
| 2.4 两组心肌颗粒酶B的免疫组化检测结果比较 |
| 2.5 心肌颗粒酶B阳性细胞与心肌病理改变的关系 |
| 2.6 两组心肌浸润细胞颗粒酶BmRNA的表达比较 |
| 3 讨论 |
（7）利用BALB/C小鼠及其原代培养心肌细胞研究川金丝猴源CVB3的致病性（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第1章 柯萨奇B3 病毒研究进展 |
| 1.1 柯萨奇病毒的形态结构及生物学特性 |
| 1.2 CVB3 基因组结构及其编码产物的功能 |
| 1.3 柯萨奇病毒的致病机制 |
| 1.4 柯萨奇病毒流行病学特点 |
| 1.5 柯萨奇病毒的检测技术 |
| 1.6 小结 |
| 第2章 柯萨奇病毒与病毒性心肌炎的研究进展 |
| 2.1 柯萨奇病毒致病毒性心肌炎致病机制 |
| 2.2 柯萨奇病毒的信号传导通路 |
| 2.3 小结 |
| 研究内容 |
| 第1章 新生乳鼠心肌细胞的原代培养及川金丝猴源柯萨奇B3 病毒感染试验 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 川金丝猴源CVB3 感染BALB/C 小鼠的病理形态学观察 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 川金丝猴源CVB3 感染BALB/C 小鼠的血液学指标变化特征 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 导师及作者简介 |
（9）羚桂龙牡颗粒对病毒性心肌炎模型小鼠作用机制的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1.祖国医学对病毒性心肌炎的研究 |
| 1.1 病因病机 |
| 1.2 辨证论治 |
| 1.2.1 分型论治 |
| 1.2.2 分期论治 |
| 1.3 专方专药 |
| 1.3.1 专药 |
| 1.3.2 专方 |
| 1.4 针剂的治疗 |
| 2.现代医学对病毒性心肌炎的认识 |
| 2.1 病毒性心肌炎的发病原因 |
| 2.1.1 肠道病毒 |
| 2.1.2 流感病毒 |
| 2.1.3 副粘病毒 |
| 2.1.4 疱疹病毒 |
| 2.1.5 肝炎病毒 |
| 2.1.6 其他病毒 |
| 2.2 病毒性心肌炎的发病机制 |
| 2.2.1 病毒直接作用于心肌组织 |
| 2.2.2 细胞外信号激酶1和2(ERK1/2)途径 |
| 2.2.3 免疫发病机制 |
| 2.3 治疗病毒性心肌炎的药物 |
| 2.3.1 免疫抑制剂 |
| 2.3.2 免疫调节剂 |
| 2.3.3 抗病毒药 |
| 2.3.4 其它药物 |
| 材料与方法 |
| 1.实验动物 |
| 2.病毒 |
| 3.实验用药 |
| 4.主要试剂、仪器与软件 |
| 4.1 主要试剂 |
| 4.2 主要溶液配制 |
| 4.3 主要仪器 |
| 5.模型制备与分组 |
| 6.给药方法 |
| 7.取材 |
| 8.观测指标与方法 |
| 8.1 HE染色观察心肌组织病理形态 |
| 8.1.1 组织处理 |
| 8.1.2 HE染色 |
| 8.1.3 病理切片评分标准 |
| 8.2 免疫组化染色步骤 |
| 8.3 电镜观察小鼠心肌超微结构 |
| 8.3.1 试剂配制 |
| 8.3.2 实验步骤 |
| 8.4 FAGS法测定T淋巴细胞CD4+和CD8+细胞亚群 |
| 9.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.心肌组织病理形态及超微结构的改变 |
| 1.1 心肌组织HE染色结果 |
| 1.2 心肌病理积分 |
| 1.3 心肌组织超微结构 |
| 2.免疫组化ERK1/2结果 |
| 3.T细胞亚群结果 |
| 讨论 |
| 1.VMC动物模型的建立及在药物治疗研究中的应用 |
| 1.1 VMC动物模型的复制 |
| 1.2 药物治疗中构建模型病毒浓度的筛选 |
| 1.3 依据小鼠VMC模型的病程对实验观察时间点的选择 |
| 1.4 动物实验观察指标的选择 |
| 2.羚桂龙牡颗粒的中医理论基础及现代药理研究 |
| 2.1 中医理论基础 |
| 2.2 羚桂龙牡颗粒的现代药理研究 |
| 3.羚桂龙牡颗粒对小鼠CVB_3-VMC的疗效 |
| 3.1 羚桂龙牡颗粒对对心肌病理形态及超微结构的影响 |
| 3.2 羚桂龙牡颗粒对ERK1/2表达的影响 |
| 3.3 羚桂龙牡颗粒对T细胞亚群的影响 |
| 3.4 展望 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 个人简历 |
（10）益气养阴、活血化瘀方对病毒性心肌疾病小鼠心肌穿孔素和颗粒酶B影响的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1.现代医学对病毒性心肌病的认识及研究进展 |
| 1.1 病因和发病机制 |
| 1.2 治疗进展 |
| 2、祖国医学对病毒性心肌病的认识及研究进展 |
| 2.1 病因病机 |
| 2.2 中医治疗进展 |
| 材料与方法 |
| 1.实验动物 |
| 2.实验病毒 |
| 3.实验药物 |
| 4.实验试剂 |
| 4.1 PCR引物 |
| 4.2 试剂盒 |
| 4.3 其它主要试剂 |
| 5.实验仪器 |
| 6.模型制备及分组 |
| 7.给药方法 |
| 8.取材 |
| 9.观测指标及方法 |
| 9.1 一般状态 |
| 9.2 心脏质量指数测定 |
| 9.3 光镜观察心肌组织 |
| 9.4 电镜观察小鼠心肌超微结构 |
| 9.5 RT-PCR法检测心肌组织PFP、GramBmRNA表达 |
| 10.统计分析 |
| 结果 |
| 1.一般状态 |
| 2.小鼠心脏质量指数变化 |
| 3.心肌组织病理形态学改变 |
| 3.1 心肌组织HE染色结果 |
| 3.2 心肌组织VG染色结果 |
| 4.心肌组织超微结构改变 |
| 5.小鼠心肌组织PFP mRNA、GramB mRNA表达检测结果 |
| 5.1 小鼠心肌组织β-actin、PFP、Gram B电泳条带比较 |
| 5.2 小鼠心肌组织PFPmRNA、GramB mRNA表达水平 |
| 讨论 |
| 1.关于病毒性心肌疾病动物模型 |
| 1.1 关于实验用病毒 |
| 1.2 关于实验用动物 |
| 1.3 关于病毒接种剂量及次数 |
| 1.4 关于造模时间及给药时间的选择 |
| 2.关于益气养阴、活血化瘀方组方依据 |
| 3.关于益气养阴、活血化瘀方的组方原则及配伍意义 |
| 4.关于益气养阴、活血化瘀方对小鼠心脏质量指数的影响 |
| 5.关于益气养阴、活血化瘀方对心肌穿孔素和颗粒酶B mRNA表达的影响 |
| 6.益气养阴、活血化瘀方对心肌病理形态及超微结构的影响 |
| 7.展望 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 附图 |
四、原位杂交法检测颗粒酶B在柯萨奇B3病毒性心肌炎小鼠心肌浸润细胞中的表达（论文参考文献）
- [1]组织蛋白酶B在病毒性心肌炎中的作用及机制研究[D]. 汪亚萍. 浙江大学, 2019(03)
- [2]影响细胞毒性T淋巴细胞在病毒性心肌炎中分布的相关研究[D]. 魏露观. 大连医科大学, 2013(05)
- [3]苦参、黄芪药对配伍对病毒性心肌炎的治疗作用及机制研究[D]. 单玉. 辽宁中医药大学, 2010(04)
- [4]实验性病毒性心肌炎心肌颗粒酶B表达的研究[J]. 叶春华,程志清. 中华微生物学和免疫学杂志, 2009(11)
- [5]病毒性心肌炎心肌颗粒酶B表达的实验研究[J]. 叶春华,程志清. 岭南心血管病杂志, 2009(05)
- [6]病毒性心肌炎免疫机制研究进展[J]. 翟莉,杨艳敏. 军医进修学院学报, 2009(04)
- [7]利用BALB/C小鼠及其原代培养心肌细胞研究川金丝猴源CVB3的致病性[D]. 盖显英. 吉林大学, 2009(08)
- [8]颗粒酶B在病毒性心肌炎发病机制中作用的研究[J]. 郭春艳,韩波. 中华微生物学和免疫学杂志, 2008(06)
- [9]羚桂龙牡颗粒对病毒性心肌炎模型小鼠作用机制的研究[D]. 朴圣爱. 黑龙江中医药大学, 2008(01)
- [10]益气养阴、活血化瘀方对病毒性心肌疾病小鼠心肌穿孔素和颗粒酶B影响的研究[D]. 吴凤兰. 黑龙江中医药大学, 2008(12)