一、LYSOPHOSPHATIDIC ACID ACTIVATES NUCLEAR NUCLEOSIDE TRIPHOSPHATASE IN RAT HEPATOCYTES（论文文献综述）
童明[1]（2021）在《5-甲氧基色氨酸经FOXO3a/miR-21/ATG5信号通路调控自噬抗肝纤维化作用及机制》文中认为肝纤维化是由肝炎病毒感染、长期饮酒、脂肪肝、胆汁淤积和自身免疫性肝炎等原因引起的肝损伤后的瘢痕组织修复过程。当肝组织持续或反复受损或炎症入侵时,肝星状细胞（HSCs）等非实质细胞活化为肌成纤维细胞并大量分泌细胞外基质（ECM）蛋白,形成纤维瘢痕,取代正常的肝组织导致肝硬化,目前针对肝纤维化和肝硬化的有效治疗药物仍然缺乏。研究目的:HSCs活化是肝纤维化发病的关键。当肝损伤发生时,HSCs被激活并增殖,促进ECM沉积和重塑并促进肝纤维化。因此,靶向HSCs是治疗肝纤维化的重要策略。5-甲氧基色氨酸（5-MTP）是色氨酸代谢的5-甲氧基吲哚代谢产物,在抵抗炎症、组织损伤修复中起重要作用。最近,5-MTP被发现能上调FOXO3a的表达。FOXO3a是一种重要的转录因子,FOXO3a可以抑制miR-21的表达。通过生信分析预测miR-21直接靶向自噬相关基因5（ATG5）,而ATG5对自噬体的形成起着关键作用,是自噬标志物之一。研究证明,抑制ATG5可阻止自噬过程,而自噬的激活则通过阻断HSCs的活化抑制肝纤维化。因此,本研究推测5-MTP可能通过调节FOXO3a/miR-21/ATG5这条全新的信号通路增加HSCs自噬,抑制肝纤维化发生。另外,5-MTP具有强大的抗炎能力,可减少成纤维细胞转分化、抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smad3信号通路、抑制细胞外基质沉积的作用,并有抑制肾脏、肺脏纤维化发生的功能,但其在肝纤维化发生的作用未曾有相关研究。因此,本研究的目的是:（1）探讨5-MTP对四氯化碳（CCl4）诱导的Sprague Dawley（SD）大鼠肝纤维化的影响。（2）探讨5-MTP对TGF-β1诱导的HSCs增殖和活化的影响。（3）探讨自噬是否在5-MTP抑制肝纤维化中发挥作用。（4）进一步研究5-MTP是否通过调控FOXO3a/miR-21/ATG5信号通路诱导自噬、抑制肝星状细胞增殖和活化。研究方法:1.动物实验分为3个组:对照组、模型组、5-MTP干预组。留取大鼠肝组织,采用苏木精-伊红染色法（HE染色）和天狼猩红染色法评估肝组织形态学变化,免疫组织化学法（免疫组化）和Western blot法检测α-SMA蛋白表达情况,采用Western blot法检测Fibronectin及细胞外基质蛋白Collagen I、Collagen III的表达。2.MTT法检测不同浓度的5-MTP（0、0.25μM、0.5μM、0.75μM、1.25μM、2.5μM）对人肝星形细胞（LX-2细胞）的毒性作用;后续细胞实验分为3个组:对照组、TGF-β1处理组、5-MTP干预组。采用细胞计数法、MTT法和Brd U增殖实验评估各实验组LX-2细胞增殖水平,采用qRT-PCR法和Western blot法分别检测各实验组LX-2细胞纤维化相关基因α-SMA、Fibronectin、Collagen I、Collagen III的m RNA和蛋白的表达。3.Western blot法检测大鼠肝组织自噬基因LC3-II/I、Beclin-1和ATG5蛋白的表达;免疫荧光法和Western blot法检测LX-2细胞LC3-II蛋白的表达。细胞实验分为4个组:对照组、TGF-β1处理组、5-MTP干预组、5-MTP与3-甲基腺嘌呤（3-MA）联合干预组。首先,免疫荧光法和Western blot实验检测各组LC3-II、Beclin-1表达以评估自噬抑制剂3-MA对自噬的抑制效果。其次,采用MTT法及Brd U增殖实验检测5-MTP单独处理或与3-MA联合处理的LX-2细胞的增殖情况。然后,采用免疫荧光法检测5-MTP单独处理或与3-MA联合处理的LX-2细胞α-SMA蛋白的表达情况。最后,Western blot法检测5-MTP单独处理或与3-MA联合处理的LX-2细胞纤维化相关基因α-SMA、Fibronectin、Collagen I、Collagen III的蛋白表达情况。4.采用qRT-PCR法及Western blot实验检测各组LX-2细胞FOXO3a的m RNA及蛋白表达;然后,染色质免疫共沉淀技术（Ch IP）及双荧光素酶实验检测FOXO3a与miR-21启动子区是否直接结合;Western blot实验检测FOXO3a过表达后LX-2细胞FOXO3a蛋白的表达。最后,qRT-PCR实验检测FOXO3a过表达LX-2细胞FOXO3a、miR-21的m RNA表达。双荧光素酶实验检测miR-21是否与ATG5直接结合;qRT-PCR法及Western blot法检测miR-21过表达LX-2细胞ATG5基因的m RNA及蛋白表达（分组:NC mimics、miR-21mimics）。5.Western blot实验检测sh-FOXO3a沉默表达的LX-2细胞FOXO3a蛋白的表达,qRT-PCR实验检测miR-21 inhibitor沉默表达的LX-2细胞miR-21 m RNA的表达。后续实验LX-2细胞分为5个组:（1）TGF-β1处理组;（2）5-MTP干预组;（3）sh-FOXO3a处理组（sh-FOXO3a与5-MTP共干预组）;（4）miR-21 inhibitor处理组（sh-FOXO3a、miR-21 inhibitor与5-MTP共干预组）;（5）NC inhibitor处理组（sh-FOXO3a、NC inhibitor与5-MTP共干预组）。首先,利用Western blot法检测FOXO3a单独干扰或与miR-21共干扰时各组LX-2细胞自噬基因LC3-II/I、Beclin-1、ATG5蛋白的表达;其次,MTT法和Brd U增殖实验检测FOXO3a单独抑制或与miR-21共干扰时各组LX-2细胞增殖情况。此外,免疫荧光实验分析FOXO3a单独抑制或与miR-21共干扰时各组LX-2细胞α-SMA蛋白的表达情况。最后,利用Western blot法检测FOXO3a单独抑制及其与miR-21共干扰时LX-2细胞α-SMA、Fibronectin、Collagen I、Collagen III蛋白表达情况。实验结果:1.大鼠肝组织病理学改变:HE染色和天狼猩红染色结果显示:对照组的肝组织中肝细胞排列整齐;模型组肝组织中肝细胞排列紊乱,可见少许出血、大量炎症细胞浸润及胶原纤维增生。而5-MTP干预组的肝组织中炎症细胞浸润大量减少、胶原纤维减少、肝细胞排列趋近正常。说明CCl4大鼠肝纤维化模型构建成功,5-MTP可减轻CCl4诱导的大鼠肝纤维化程度。免疫组化和Western blot检测结果显示:α-SMA蛋白在模型组肝组织中显着升高,在5-MTP干预组中较模型组显着降低。说明5-MTP能够抑制CCl4诱导的大鼠肝组织肌成纤维细胞转化。Western blot结果显示:Fibronectin、Collagen I、Collagen III蛋白在模型组肝组织中表达升高,在5-MTP干预组肝组织中表达降低,说明5-MTP能够逆转CCl4诱导的大鼠肝纤维发生。2.MTT检测结果显示0.75μM、1.25μM、2.5μM浓度的5-MTP均对肝细胞具有毒性作用（P<0.05）。而0.25μM和0.5μM浓度的5-MTP对LX-2细胞增殖无影响（P>0.05）。因此选择0.5μM的5-MTP作为后续实验的浓度。TGF-β1处理组LX-2细胞数量较对照组增加（P<0.001）。而5-MTP与TGF-β1联合作用时,细胞数量明显减少（P<0.001）。同时,MTT法检测的细胞活力和Brd U结果显示LX-2细胞增殖能力在TGF-β1处理后均较对照组明显增强（P<0.01）,而5-MTP预处理使细胞增殖能力下降（P<0.01）。结果表明5-MTP能够减缓TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖。qRT-PCR和Western blot检测结果显示:TGF-β1处理后的LX-2细胞α-SMA、Fibronectin、Collagen I、Collagen III的m RNA与蛋白表达增加（P<0.01）,而5-MTP可逆转TGF-β1诱导的LX-2细胞α-SMA、Fibronectin、Collagen I、Collagen III的m RNA与蛋白表达的增加（P<0.05）。结果表明5-MTP可抑制TGF-β1对肝星状细胞的活化作用。3.LC3-II/I、Beclin-1和ATG5蛋白在5-MTP处理的CCl4诱导的大鼠肝纤维组织中表达升高（P<0.05）,LC3-II蛋白在5-MTP干预的TGF-β1诱导的LX-2细胞中表达增加（P<0.05）,说明5-MTP可激活自噬。免疫荧光检测显示联合3-MA处理后,LC3-II蛋白表达较5-MTP单独处理组表达降低（P<0.001）,Western blot实验显示联合3-MA处理后LC3-II/I、Beclin-1蛋白表达较5-MTP单独处理组表达降低（P<0.001）,证明3-MA能够抑制自噬。MTT及Brd U实验结果显示:5-MTP与3-MA联合处理组中活化的LX-2细胞活力与增殖速度比5-MTP单独处理快（P<0.05）,说明3-MA能够逆转5-MTP对活化的LX-2细胞增殖的抑制,以及5-MTP通过调控自噬抑制肝星状细胞增殖。免疫荧光和Western blot实验结果显示:3-MA与5-MTP联合处理组中,活化的LX-2细胞中α-SMA、Fibronectin、Collagen I、Collagen III蛋白表达显着比5-MTP单独处理组高（P<0.05）,说明3-MA能够逆转5-MTP对LX-2细胞纤维化相关基因表达的抑制作用,以及5-MTP通过调控自噬抑制肝星状细胞纤维化相关基因的表达。4.qRT-PCR及Western blot实验发现FOXO3a m RNA和蛋白表达在5-MTP处理后显着增加（P<0.01）。Ch IP、双荧光素酶实验结果证实FOXO3a与miR-21启动子区直接结合。qRT-PCR及Western blot实验证明FOXO3a过表达质粒构建成功。qRT-PCR检测发现FOXO3a过表达可抑制miR-21的转录表达（P<0.01）。双荧光素酶实验结果证实miR-21直接靶向ATG5。qRT-PCR及Western blot分析显示miR-21过表达能抑制ATG5基因的m RNA及蛋白表达（P<0.05）。5.Western blot实验证实sh-FOXO3a沉默表达质粒构建成功,qRT-PCR实验检测miR-21 inhibitor沉默表达质粒构建成功。LX-2细胞自噬基因LC3-II/I、Beclin-1、ATG5蛋白表达水平在sh-FOXO3a处理组比5-MTP干预组表达降低（P<0.05）,在miR-21 inhibitor处理组较sh-FOXO3a处理组表达升高（P<0.05）,说明5-MTP通过FOXO3a/miR-21/ATG5调控肝星状细胞自噬。5-MTP处理的LX-2细胞增殖速度在sh-FOXO3a处理组中较5-MTP干预组增快（P<0.01）,而在miR-21 inhibitor处理组比sh-FOXO3a处理组减慢（P<0.05）,说明5-MTP通过调控FOXO3a/miR-21/ATG5信号通路诱导的自噬抑制肝星状细胞增殖。α-SMA、Fibronectin、Collagen I、Collagen III蛋白表达在sh-FOXO3a处理组较5-MTP干预组高（P<0.05）,而在miR-21 inhibitor处理组较sh-FOXO3a处理组降低（P<0.05）,说明5-MTP通过调控FOXO3a/miR-21/ATG5信号通路诱导的自噬抑制肝星状细胞纤维化相关基因表达。结论:本研究首次证明5-甲氧基色胺酸在体内研究中可减少四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化,并在体外试验中抑制转化生长因子-β1激活的肝星状细胞增殖和活化。进一步研究发现,自噬在5-MTP抑制活化肝星状细胞的增殖和活化中起着关键作用,而FOXO3a/miR-21/ATG5这一全新的信号通路在5-MTP调节自噬、抑制肝星状细胞的增殖和活化中起着关键作用。因此,本研究证明:5-甲氧基色氨酸经FOXO3a/miR-21/ATG5信号通路调控自噬抑制肝纤维化发生。
杨傲[2]（2021）在《环丙烯类脂肪酸对蛋鸡肝脏脂质代谢和蛋品质的影响及机制研究》文中进行了进一步梳理棉籽饼粕作为一种经济且营养价值较高的蛋白质饲料,可部分替代饲料中的豆粕或鱼粉用以降低饲料成本。但棉籽饼粕因其含有各种抗营养因子,如棉酚、环丙烯类脂肪酸（Cyclopropenoid fatty acids,CPFAs）等,导致在蛋鸡生产使用过程中出现诸多问题,如产蛋率下降、死淘率上升、出现“橡皮蛋”等。橡皮蛋是一种以蛋黄煮熟后变硬为特征的异常鸡蛋,严重影响蛋品的口感和商品价值。过去橡皮蛋的形成被认为与棉酚中毒有关,但越来越多的证据显示可能与CPFAs导致蛋鸡肝脏脂质代谢变化有关,关于棉酚和CPFAs在橡皮蛋形成中所起的作用长期存在争议。因此,本研究旨在探究棉籽饼粕中的抗营养因子CPFAs和棉酚对蛋鸡肝脏健康、脂质代谢及橡皮蛋形成的影响,明确棉籽饼粕中导致橡皮蛋形成的主要抗营养因子,并阐明不良生理效应产生的机制,为蛋禽生产中合理利用棉籽饼粕提供理论依据。本文分为4个试验,主要研究方法和研究结果如下。试验一:日粮中棉粕和棉油对蛋鸡生产性能和脂质组成的影响以24周龄海兰褐蛋鸡作为试验动物,高酚棉粕（游离棉酚含量693.81 mg/kg）和脱酚棉油（环丙烯类脂肪酸含量0.20%）作为试验材料,分别以0%、6%、12%和0%、2%、4%的比例替代基础日粮中的豆粕和豆油配制试验日粮,采用两因素三水平交叉试验设计将162只蛋鸡随机分为9组,每组6个重复,饲喂试验日粮。预饲1周,正式试验8周。研究了棉粕和棉油对蛋鸡生产性能、肝脏组织学形态、胆固醇和脂肪酸组成等的影响。主要试验结果如下:日粮中的棉油显着降低蛋鸡的生产性能（P<0.05）,尤其是4%棉油添加组,在试验中后期产蛋率均未超过90%,最后两周产蛋率下降到85%以下。棉油组蛋重在试验最后两周出现降低（P<0.05）,同时蛋鸡采食量也持续减少。肝脏切片观察发现,棉油诱发蛋鸡肝脏组织学形态结构改变,而棉粕导致肝脏脂滴增多。日粮中添加棉油显着改变蛋鸡体内脂肪酸组成,并存在组织间差异。与0%棉油组相比,4%棉油添加组的蛋鸡肝脏硬脂酸含量升高了15%,而油酸降低了10.3%,并且必需脂肪酸DHA也显着减少（P<0.05）;4%棉油添加组的蛋鸡胸肌中的肉蔻油酸、棕榈酸、珍珠酸、硬脂酸、花生三烯酸和花生四烯酸显着升高（P<0.05）,而棕榈油酸、油酸、α-亚麻酸显着降低（P<0.05）;棉油添加组的腹脂中脂肪酸变化与胸肌变化规律一致,而腿肌脂肪酸变化不明显。此外,棉油还增加了蛋鸡胸肌和腿肌中胆固醇的含量（P<0.05）。由此可见,棉油可以改变蛋鸡体内脂质代谢,影响肝脏功能,并造成蛋鸡生产性能降低。试验二:CPFAs和棉酚对蛋鸡肝脏脂质代谢的影响及机制以45周龄海兰褐蛋鸡为试验对象,采用两因素两水平交叉试验设计将96只蛋鸡随机分为4组,每组6个重复。对照组饲喂基础日粮,其他3个试验组分别饲喂添加350 mg/kg CPFAs、200 mg/kg棉酚以及同时添加350 mg/kg CPFAs和200 mg/kg棉酚的日粮。预饲1周,正式试验4周。研究了CPFAs和棉酚对蛋鸡生产性能、肝脏健康、脂肪酸组成、血液参数和脂质代谢等的影响。在明确CPFAs是影响蛋鸡肝脏脂质代谢的主要因素后,借助多组学联合分析的方法,分析了CPFAs导致肝脏脂质代谢紊乱和产生脂质毒性的可能机制。主要研究结果如下:日粮中添加350 mg/kg CPFAs显着（P<0.05）降低了蛋鸡采食量。蛋鸡肝脏切片观察发现,日粮中CPFAs导致蛋鸡肝脏中大量脂滴积累,并且伴随TG（甘油三脂）含量增加（P<0.05）,同时血清中TG水平显着下降（51.1%）（P<0.05）,说明肝脏中TG分泌受阻。并且,CPFAs显着提高了蛋鸡血清中AST（谷草转氨酶）活性（49.7%）（P<0.05）。蛋鸡肝脏脂肪酸组成表明,CPFAs抑制硬脂酰Co A脱氢酶活性,导致肝脏饱和脂肪酸增加（P<0.01）,而单不饱和脂肪酸降低（P<0.01）,其中硬脂酸和油酸变化幅度较大,分别提高46%和降低了23.4%（P<0.05）。蛋鸡红细胞膜脂肪酸组成变化规律与肝脏一致,CPFAs增加了其中硬脂酸含量（24.1%）（P<0.05）,而降低了棕榈油酸（66.7%）和油酸（22.1%）的含量（P<0.05）。同时,CPFAs改变了蛋鸡肝脏脂质代谢相关基因表达,显着下调（P<0.05）了蛋鸡肝脏中脂质组装和转运相关基因APOB100、APO VLDL-（?）、APOA1、LPL、GRP78和VTG,抑制了VLDL的合成和转运。然而,棉酚对蛋鸡脂质的组成和脂质转运无明显影响。这部分结果说明CPFAs是影响蛋鸡肝脏脂质代谢的主要因素,而并非棉酚。肝脏转录组和脂质组数据分析发现CPFAs组蛋鸡肝脏脂质代谢物分布和相关基因转录表达水平发生了显着变化。脂质组分析结果表明,CPFAs增加了蛋鸡肝脏中TG、PC（磷脂酰胆碱）、LPC（溶血磷脂酰胆碱）的含量（P<0.05）,而减少了DG（甘油二脂）、LPE（溶血磷脂酰乙醇胺）含量（P<0.05）。与对照组先比,CPFAs组DG、TG、LPC、LPE、CER（神经酰胺）侧链脂肪酸的不饱和度也出现降低。CPFAs组显着变化的甘油酯有15种,甘油酯侧链脂肪酸C16和C18脱氢指数随CPFAs添加也出现降低（P<0.05）。CPFAs组显着变化的PC脂质分子有20个,PE有38个,CPFAs显着提升了蛋鸡肝脏PC/PE的比率。转录组分析结果表明,CPFAs组差异表达的基因有1423个（Q<0.001,fold change>1.5）。其中KEGG显着富集（Q<0.05）的通路中与脂质代谢相关的包括:PPAR信号通路、胆固醇代谢通路和丙酮酸代谢通路。此外,CPFAs的添加导致蛋鸡肝脏甘油酯和甘油磷脂通路多个基因和脂质代谢物发生显着变化。值得注意的是,CPFAs还下调了内质网伴侣分子的表达。因此,推测CPFAs主要通过激活PPAR通路调节脂质转运、改变磷脂组成和饱和度影响细胞膜功能、减弱内置网上蛋白质加工折叠的能力来抑制VLDL的合成和分泌,最终造成肝脏脂质积累,产生脂质毒性。试验三:鸡蛋储藏条件在橡皮蛋形成中的作用在试验二的基础上,收集第2周和第4周鸡蛋作为试验材料,按照试验二设计将鸡蛋分为4个组,每组6个重复。首先通过研究棉酚和CPFAs对鸡蛋品质、蛋黄脂肪酸、胆固醇、棉酚残留、熟蛋黄质构和结构等方面的影响,确定CPFAs是造成橡皮蛋形成的主要因素后,将试验期结束时收集的正常蛋（对照组）和橡皮蛋（CPFAs组）在不同温度（4℃和25℃）下储藏不同时间（0,14和28天）,观察蛋黄物理化学特性和外观等的变化。主要实验结果如下:CPFAs显着改变了蛋黄脂肪酸组成和胆固醇含量,体现为饱和脂肪增多（P<0.01）,单不饱和脂肪酸减少（P<0.01）,胆固醇含量降低（P<0.01）。并且CPFAs显着增加了蛋黄硬度（P<0.01）等质构指标,导致形成橡皮蛋。微观结构观察发现,蛋黄卵黄球结构改变、轮廓模糊、有融合的趋势,从而导致橡皮蛋出现切面光滑,质地紧实的现象。以上结果说明CPFAs是导致橡皮蛋形成的主要因素,而并非是棉酚。不同条件储藏后,CPFAs组橡皮蛋黄物理化学特性变化明显,而正常鸡蛋变化不大。室温下储藏后橡皮蛋硬度急剧下降（P<0.05）,而低温下储藏的橡皮蛋硬度先降低后增大。橡皮蛋胶黏性、咀嚼性呈现与硬度同样变化规律。蛋黄黏性温度扫描曲线发现,新鲜橡皮蛋蛋黄黏性显着大于正常鸡蛋（P<0.001）。在室温和低温下储藏28天后,橡皮蛋和正常鸡蛋蛋黄黏性曲线的初始黏性、渐近线均显着下降（P<0.05）,其中橡皮蛋变化幅度较大。在室温或低温储藏过后,橡皮蛋蛋黄重量、水分和蛋黄指数均显着增加（P<0.05）,且橡皮蛋水分在室温下转移较低温下更多。此外,橡皮蛋的蛋黄室温下储藏出现面粉样糊状斑块,低温下储藏呈现半凝固状态;蛋清在储藏过后发生褐色污斑,室温下储藏变色更加严重。而正常蛋在储藏后未出现明显变化。以上结果表明,CPFAs是橡皮蛋形成的基础,而长期储藏并不影响橡皮蛋的形成,但室温和低温储藏均会加剧橡皮蛋品质的进一步恶化。试验四:L-半胱氨酸和大豆磷脂缓解橡皮蛋形成及CPFAs肝脏脂质毒性的研究以55周龄海兰褐蛋鸡为试验动物,共96只,随机分为4组,每组6个重复。分别饲喂基础日粮（对照组）、基础日粮添加200 mg/kg CPFAs（CPFAs组）、基础日粮添加200 mg/kg CPFAs和1000 mg/kg L-半胱氨酸（半胱氨酸组）以及基础日粮添加200 mg/kg CPFAs和5000 mg/kg大豆磷脂（大豆磷脂组）。结果表明:L-半胱氨酸和大豆磷脂无法有效缓解CPFAs造成的蛋黄脂肪酸不饱和度和胆固醇含量的降低。但L-半胱氨酸可一定程度降低CPFAs导致的蛋黄变硬（P<0.05）,而大豆磷脂能有效改善CPFAs导致的蛋鸡肝脏脂质积累（P<0.05）。综上所述,本研究得出以下结论:（1）日粮中4%棉油可以降低蛋鸡生产性能和影响蛋鸡肝脏脂质代谢。（2）350 mg/kg CPFAs可造成蛋鸡肝脏脂质代谢紊乱。CPFAs通过抑制肝脏硬脂酰Co A脱氢酶的活性改变脂肪酸组成,调节肝脏脂质转运相关载脂蛋基因的表达,削弱内置网蛋白质加工折叠能力,从而导致VLDL合成和分泌减少,造成脂质在肝脏中积累。（3）CPFAs是导致橡皮蛋形成的主要因素,它通过降低蛋黄脂肪酸不饱和度,改变卵黄球结构,来增加蛋黄硬度。储藏过程对橡皮蛋的形成没有影响,但会导致橡皮蛋理化性质的改变,从而进一步加剧橡皮蛋品质的恶化。（4）L-半胱氨酸可以缓解橡皮蛋变硬,大豆磷脂可以改善肝脏脂质积累。
马勇刚[3]（2021）在《P2X7受体在镉致小鼠骨质疏松中的作用》文中研究表明镉作为有毒的重金属污染物,广泛分布于环境中,通过直接和间接方式进入人类和动物体内,主要蓄积在肝、肾和骨骼,其生物半衰期在体内可长达10-30年,目前镉对骨骼代谢的毒性机制尚未明确。近年来P2X7受体对骨代谢的调控受到广泛关注。通过药理学方式激活或抑制P2X7受体研究成骨细胞和破骨细胞功能的变化,发现P2X7受体敲除的小鼠没有表现出明显的骨代谢异常,但去卵巢小鼠骨质疏松模型P2X7受体敲除加剧骨质疏松症状。然而,P2X7受体对成骨细胞和破骨细胞功能的调控机制尚未阐明。本研究以小鼠骨髓间充质干细胞和骨髓单核巨噬细胞为体外研究模型并结合小鼠体内实验,探索镉暴露不同时间对成骨细胞和破骨细胞分化的影响,通过Western blot、qRT-PCR、免疫荧光、免疫组化、流式细胞术等实验技术,检测细胞分化和凋亡相关指标,从分子水平揭示镉致小鼠骨骼损伤的机制,为预防和治疗镉中毒提供新的理论依据和治疗靶点。主要研究内容如下:1.镉对成骨细胞和破骨细胞分化的影响以成骨细胞和破骨细胞前体细胞为研究模型,用Western blot、ALP染色、茜素红染色等方法检测了成骨细胞和破骨细胞分化相关的指标。长期（72h）镉暴露后,镉抑制了骨髓间充质干细胞的成骨和矿化,成骨关键蛋白COL1A1、OPN和OCN以及成骨调控因子RUNX2的蛋白和基因表达水平显着下调（p<0.01）。长期镉暴露也明显抑制了破骨细胞的形成和骨吸收活性,破骨细胞分化及骨吸收关键蛋白TRAP、CAII、CK和MMP-9的表达水平显着低于对照组（p<0.01）,调控破骨细胞分化关键因子NFATc1的蛋白表达也显着下降（p<0.01）。短期（12h）镉暴露后,成骨细胞和破骨细胞分化的后期细胞存活率明显增加（p<0.01）,细胞凋亡率降低（p<0.01）。Western blot检测成骨细胞和破骨细胞的自噬过程,短期镉暴露显着抑制了成骨细胞LC3II的累积,增加了P62的表达（p<0.01）;而短期镉暴露增加了破骨细胞中LC3II的累积,加速了 P62的降解过程（p<0.01）。在破骨细胞分化后期添加镉处理12 h,结果显示破骨细胞的骨吸收活性增加（p<0.01）,伪足小体结构较对照组更加明显,破骨细胞黏附关键蛋白Integrinαvβ3的表达显着上调（p<001）,伪足小体关键蛋白Paxillin、Vinculin、PYK2和SRC的磷酸化水平显着增加（p<001）。结果表明,长期镉暴露抑制了成骨细胞和破骨细胞的分化,而短期镉暴露更有利于成骨细胞和破骨细胞存活。2.P2X7受体在镉抑制成骨细胞和破骨细胞分化中的作用为了探讨P2X7受体在镉抑制成骨细胞和破骨细胞分化中的作用,本试验用腺病毒和慢病毒转染细胞建立P2X7敲减和过表达的细胞模型,用Western blot、ALP染色、茜素红染色和TRAP染色等方法检测了成骨细胞和破骨细胞分化相关的指标。结果显示,长期镉暴露后P2X7受体蛋白表达水平呈剂量依赖性降低（p<0.01）,其下游PI3K/AKT信号也显着抑制（p<0.01）。P2X7受体敲减明显抑制了成骨细胞ALP活性和矿化结节的形成,成骨关键蛋白的表达显着降低（p<0.01）,破骨细胞的数量和骨吸收活性也显着降低（p<0.01）,骨吸收关键蛋白的表达显着下调（p<0.01）。过表达P2X7受体后长期镉暴露对成骨细胞和破骨细胞分化的抑制作用显着缓解（p<0.01）。而阻断P2X7/PI3K/AKT信号后,长期镉暴露对成骨细胞和破骨细胞分化的抑制作用显着增强（p<0.01）。结果表明,P2X7/PI3K/AKT信号通路在镉抑制成骨细胞和破骨细胞分化的过程中发挥了重要作用。3.镉致小鼠骨质疏松发病机制的研究为了进一步验证镉对小鼠骨质疏松的影响,本试验建立小鼠镉中毒模型。用MicroCT、TRAP染色、ALP染色、组织学和Western blot等方法检测骨质疏松相关指标。结果显示,与对照组相比,短期（4个月）镉暴露后骨相关参数BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、BMD和SMI均无显着性变化（p>0.05）,镉暴露未引起明显病理组织学变化,但骨组织中可见大量的破骨细胞,显着高于对照组（p<0.01）,成骨细胞数量显着减少（p<0.01）,骨组织中成骨关键蛋白和凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3的表达显着降低（p<0.01）。长期（15个月）镉暴露后,与对照组相比,骨相关参数:BV/TV、Tb.Th、Tb.N 和 BMD 显着降低（p<0.01）,而 Tb.Sp、SMI 值显着升高（p<0.01）;对照组骨组织未见明显病理变化,镉组骨组织染色均匀,局部可见大量成骨组织被软骨组织取代,未见明显炎症,骨髓中可见大量造血细胞及多核巨细胞;破骨细胞和成骨细胞数量显着低于对照组（p<0.01）;成骨和骨吸收关键蛋白的表达显着降低（p<0.01）,而凋亡蛋白的表达显着增加（p<0.01）。长期和短期镉暴露均显着抑制P2X7/PI3K/AKT信号相关蛋白表达（p<0.01）。总之,长期镉暴露小鼠表现出明显的骨质疏松,而短期暴露并未表现出骨质疏松症状。综上所述,①长期镉暴露可致小鼠发生明显的骨质疏松,短期暴露并未表现出骨质疏松症;②抑制成骨细胞和破骨细胞分化是长期镉暴露诱导骨质疏松的主要原因,促进破骨细胞活性是短期镉暴露致骨质疏松的早期表现;③短期镉暴露抑制成骨细胞和破骨细胞发生凋亡,细胞自噬在此过程扮演了保护作用,长期镉暴露促进骨组织凋亡;④P2X7受体敲减抑制了成骨细胞和破骨细胞的分化,过表达P2X7受体阻止了镉对成骨细胞和破骨细胞分化的抑制作用。
郭民康[4]（2021）在《基于UPLC-MS/MS的股骨头坏死骨组织外泌体代谢组学分析》文中认为背景:股骨头坏死（Osteonecrosis of the femoral head,ONFH）是一种可导致股骨头塌陷进而发生髋关节残疾的疾病,其中,30%-70%的病例出现双侧坏死,该病严重影响患者的生活,给社会带来极大的经济负担。然而,ONFH的确切发病机制仍不清楚,大部分患者最后仍需行全髋关节置换手术（THA）。许多研究证实,外泌体在骨关节疾病中发挥了积极的意义。骨组织中所有细胞均能分泌外泌体,其内容物的装载是由骨组织内细胞的状态决定的。因此,外泌体内容物的变化可以反映骨组织细胞内的生理变化。目前,尚无关于ONFH外泌体内代谢物变化的研究。代谢组学是最常用于分析代谢物变化的技术,它是基于分析化学技术,对代谢产物进行准确而又高效地定性或者定量分析。因此,运用超高效液相色谱/串联质谱（UPLC-MS/MS）技术研究股骨头坏死骨组织外泌体的代谢特征,这有助于我们发现疾病的新的代谢变化机制。目的:通过分析来源于股骨头坏死组织的外泌体内的代谢特征,阐释ONFH疾病的代谢变化,探究其发生重要改变的代谢通路,为研究ONFH的发病机制和治疗方法提供理论依据。方法:1、收集30例股骨头坏死（ONFH）骨组织和30例股骨颈骨折（FNF）骨组织标本,对每例患者进行X射线,核磁共振（MRI）和组织学检查,明确诊断。2、将股骨头组织标本研磨后,利用超速离心法提取外泌体。将提取出来的外泌体用动态光散射仪（DLS）、透射电子显微镜（TEM）和蛋白质印迹法鉴定。3、使用超高效液相色谱/串联质谱（UPLC-MS/MS）分析ONFH外泌体的代谢物谱,并对代谢数据进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）来分析外泌体的代谢谱,并找到其中变化明显的代谢物。4、筛选出变化最明显的代谢物作为潜在的诊断标志物,进行受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析,评估其诊断意义。5、通过Metaboanalyst数据库分析变化明显的代谢物,从而确定其代谢通路并进行可视化。结果:1、成功收集30例ONFH骨组织和30例FNF骨组织标本。对比每例患者的X射线,核磁共振（MRI）和组织学检查结果,确认诊断正确。2、DLS的结果显示,这些外泌体的大小大都在30 nm-150 nm之间。TEM分析显示外泌体为双层脂质包裹,类圆盘状形态,大小在100nm左右。Western blot显示外泌体的标记物CD9、TSG101、CD63和ALIX显着富集。以上结果表明组织中的外泌体已成功分离。3、外泌体样本经上述条件分析后得到的数据,经处理后得到PCA图。结果显示,来自于ONFH的外泌体的成分和来自于FNF的外泌体的成分在维度上,两者有一定的分离趋势。OPLS-DA运用正交偏最小二乘判别分析建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型,来实现对样品类别的预测。模型评价参数R2Y、Q2分别为0.749、0.724,R2Y和Q2均大于0.5,表明模型稳定可靠。4、差异代谢物的生物信息学分析显示,在来源于ONFH和FNF的外泌体之间检测到45种差异代谢物。我们筛选出赖氨酸、溶血磷脂、脯氨酸和磷脂酸作为潜在的生物标志物。5、代谢通路分析显示,在来自于ONFH的外泌体中,核黄素代谢、泛酸和辅酶a生物合成和甘油磷脂代谢改变最为显着。结论:我们的研究通过对ONFH患者组织提取的外泌体进行代谢谱分析,并构建了PCA和OPLS-DA模型,共鉴定45种差异代谢物。确定了4种潜在的生物标志物（赖氨酸、溶血磷脂、脯氨酸和磷脂酸）。代谢通路分析显示,在来自于ONFH的外泌体中,核黄素代谢、泛酸和辅酶a生物合成和甘油磷脂代谢与ONFH最相关。
张静慧[5]（2021）在《基于多组学策略研究蟾酥中活性成分对肝癌的治疗作用及其机制》文中指出肝癌是一种发病率高的恶性肿瘤,具有较高的死亡率。虽然肝癌可以手术切除,但药物治疗对晚期患者有着不可替代的作用。然而,化疗药物仍受到许多不利因素的限制,如副作用和耐药性。因此,急需寻找更有效的药物治疗方案。中药具有较低的副作用,并通过其复杂成分的整体作用治疗疾病,在复杂性疾病和慢性病的治疗中发挥着独特的优势。中药蟾酥是蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥分泌物,研究证实其具有抗肿瘤作用。迄今为止,对其抗肿瘤作用机制的研究大多是对其中单一活性成分的单独评价,很难解释其在临床中的多种活性成分联用的机制。因此,蟾酥中活性成分在肝癌治疗中的相互作用及其机制的研究应引起重视。因此,本论文综合运用代谢组学、脂质组学、肠道微生物组学等分析方法,探究蟾酥中活性成分在肝癌治疗中的相互作用及潜在机制,并通过质谱成像、病理切片观察、基因表达检测等技术对关键基因和代谢通路在体内、外进行验证。本论文主要研究内容和结果如下:1.蟾酥中活性成分在肝癌治疗中的相互作用通过细胞活力实验研究蟾酥中主要活性成分蟾毒灵、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基单用及联用对Hep G2肝癌细胞的作用,结果表明三者对肝癌细胞均有抑制作用,相较于酯蟾毒配基,蟾毒灵和华蟾酥毒基对肝癌细胞的抑制作用更强。利用两个经典药物相互作用模型（Chou-Talalay模型和Bliss Independence模型）从体外评价蟾毒灵、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的相互作用,明确了蟾毒灵与华蟾酥毒基的协同药效。构建小鼠异种移植瘤模型,从体内研究的角度验证蟾毒灵与华蟾酥毒基的协同药效,结果显示二者联用对肿瘤的抑制作用较强,其药效与阳性对照药顺铂相近,且未导致化疗药常见的体重降低的副作用。体内、外研究结果综合表明蟾毒灵与华蟾酥毒基联用在肝癌治疗中可发挥增效减毒的作用。2.蟾毒灵及华蟾酥毒基联用治疗肝癌的代谢组学研究釆用基于液相色谱-质谱法（Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS）的代谢组学对不同处理组的肝癌细胞和移植瘤组织进行分析,研究蟾毒灵与华蟾酥毒基对肝癌代谢的影响,揭示了蛋氨酸代谢、能量代谢和氨基酸代谢在蟾毒灵与华蟾酥毒基发挥抗肿瘤药效中的作用,代谢的调控可引发线粒体膜电位降低、ROS积累及能量代谢抑制,从而发挥抗肿瘤作用。3.蟾毒灵及华蟾酥毒基联用治疗肝癌的脂质组学及质谱成像研究通过基于LC-MS的脂质组学分析蟾毒灵与华蟾酥毒基对脂质调控的影响,从脂质变化的角度解释二者的抗肿瘤机制,发现蟾毒灵与华蟾酥毒基联用可导致鞘脂和甘油磷脂的代谢失调,进而引起生物膜系统破坏和线粒体驱动的细胞凋亡。在脂质组学研究的基础上,通过基质辅助激光解吸电离质谱成像（Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging,MALDI-MSI）研究蟾毒灵与华蟾酥毒基的主要作用区域,发现与二者抗肿瘤作用相关的关键脂质主要分布于肿瘤的非坏死区,表明二者可以穿透肿瘤并在肿瘤的非坏死区发挥作用。4.基于代谢组学与脂质组学的生物学验证通过线粒体膜电位测定、Seahorse XF细胞能量代谢分析、氧化应激指标测定和实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain,q PCR）等分子生物学实验验证蟾毒灵与华蟾酥毒基发挥抗肿瘤作用的关键通路和潜在机制。结果表明,线粒体膜电位降低、能量代谢抑制、ROS积累、生物膜系统破坏是蟾毒灵与华蟾酥毒基发挥抗肿瘤作用的重要机制。5.蟾毒灵及华蟾酥毒基联用治疗肝癌的肠道微生物组学研究通过肠道微生物组学研究蟾毒灵与华蟾酥毒基对荷瘤小鼠肠道微生物多样性的影响,结果表明,蟾毒灵与华蟾酥毒基联用会导致小鼠肠道微生物多样性显着提高。并发现二者联用导致酸杆菌门丰度及厚壁菌门与拟杆菌门丰度的比值提高,这代表机体健康状态的提升。该结果从肠道微生物对机体整体调节的角度初步阐释蟾毒灵与华蟾酥毒基抗肝癌的作用机制。
王新[6]（2021）在《基于肥大细胞调控肥胖和能量代谢的机制研究白杨素干预高脂饮食相关代谢性疾病的作用》文中提出脂肪组织作为主要的储能器官,在维持体内能量稳态过程中发挥重要作用。白色脂肪组织中不仅有典型的白色脂肪细胞,还零星分布着可以诱导产热的浅棕色脂肪细胞。白色脂肪组织基质血管相（stromal vascular faction,SVF）中的肥大细胞（MC）等免疫细胞、前脂肪细胞以及内皮细胞等,通过与脂肪细胞的互作而调控脂肪组织和机体的能量稳态。2009年,本团队报道了MC通过影响白色脂肪组织血管化,关键地控制了高胆固醇的西方饮食（Western diet,WD）所诱导的肥胖和胰岛素抵抗。此后,另一些研究团队报道,对于高脂饮食（High-fat diet,HFD）所诱导的肥胖和胰岛素抵抗,MC没有明确的影响。为进一步明确MC及其食品源稳定剂白杨素调控饮食诱导的肥胖（Diet-induced obesity,DIO）和能量消耗的作用机制,本研究开展了以下三个方面的工作:1)明确了MC在饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗发生中的作用。在WD、HFD和胆固醇补充的高脂饮食（High-fat Diet+cholesterol,HFD+Cho）喂养的小鼠中,我们分别探究了MC稳定剂色甘酸钠（disodium cromoglycate,DSCG）和酮替芬腹腔注射对DIO和胰岛素敏感性的影响。在WD和HFD+Cho等高胆固醇饮食喂养的小鼠中,DSCG和酮替芬显着改善了小鼠的肥胖和胰岛素抵抗;在HFD喂养的小鼠中,酮替芬改善肥胖和胰岛素抵抗的效果相对于高胆固醇饮食喂养的小鼠明显减弱,而DSCG则完全没有作用。DSCG和酮替芬处理,阻止了高胆固醇饮食诱导的血液组胺升高和脂肪组织MC脱颗粒,且血浆中组胺浓度与总胆固醇或低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein,LDL）呈显着正相关。LDL等处理显着激活MC,DSCG和酮替芬抑制了LDL所诱导的MC活化,而LDL受体缺失则抵消了DSCG或酮替芬对LDL所诱导MC活化的作用。这些结果表明,MC在高胆固醇饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗中发挥关键作用,而食品源胆固醇导致了相关的MC活化。2)揭示了MC调控机体脂肪组织棕色化和能量消耗的作用机制。既然MC在DIO的发生中起着固有的关键作用,我们有必要去揭示其对脂肪细胞棕色化和相关能量消耗的影响。因此,本论文进一步研究了MC功能失活后的能量消耗和脂肪组织棕色化水平的改变。MC的缺失和药物稳定显着增强了去甲肾上腺素诱导的能量代谢,提升了皮下脂肪组织（Subcutaneous adipose tissue,SAT）的棕色化。在MC缺失的Kitw-sh/w-sh小鼠SAT中回复MC则可逆转这些变化。机制研究表明,MC失活促进SAT中血小板生长因子受体（Platelet-derived growth factor receptor,PDGFR）α阳性脂肪细胞祖细胞的增殖和棕色分化。进一步,我们确定了MC是脂肪组织中5-羟色胺的主要来源,而MC分泌的5-羟色胺抑制了SAT的棕色化和系统能量消耗。总之,MC通过释放5-羟色胺,抑制了小鼠SAT的棕色化和系统的能量消耗。3)阐明了食品源MC稳定剂白杨素干预小鼠DIO和能量消耗作用机制。白杨素是一种食品源的MC强稳定剂。我们研究发现白杨素作为饮食补充剂,可改善HFD诱导的小鼠体重获得和脂肪组织重量增加,降低机体胰岛素抵抗。白杨素增加了系统能量消耗,提升了SAT棕色化及浅棕色前脂肪细胞数量和血管生成,升高了SAT中PDGFRα的表达、PDGFRα+脂肪细胞祖细胞的数量和棕色化水平。进一步,我们发现白杨素诱导了SAT的SVF细胞的棕色分化,而PDGFRα特异性抑制剂伊马替尼逆转了这一作用。最后,我们发现,饮食白杨素降低了小鼠SAT中抑制PDGFRα活化或脂肪细胞棕色化的micro RNA表达水平。综上,饮食白杨素通过调控PDGFRα活化及相关micro RNA表达,促进小鼠的SAT的棕色化和系统能量消耗,进而改善DIO和胰岛素抵抗。综上所述,本论文明确了MC在饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗发生中的关键作用;揭示了MC通过释放5-羟色胺抑制SAT棕色化和系统能量消耗的机制;阐明了食品源MC稳定剂白杨素可通过调控PDGFRα活化及相关micro RNA表达,启动小鼠的SAT的棕色化和系统能量消耗,进而改善DIO和胰岛素抵抗。
张慧[7]（2020）在《下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展》文中研究表明背景能量代谢重编是肿瘤重要特点,脂肪酸代谢异常是其中之一。近年多项研究表明,肿瘤普遍存在脂肪酶过度表达的状况,众多研究拟探索脂肪酶抑制剂作为癌症潜在治疗方法。本研究旨探索乙酰辅酶A羧化酶A（Acetyl-CoA Carboxylase-A,ACACA）基因对前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）细胞及线粒体功能,代谢产物和动物体内肿瘤形成影响。方法免疫组织化学检测ACACA在人前列腺癌组织芯片中的表达,评估不同临床分期病理分级中的情况。公共数据库GEPIA分析ACACA在人前列腺癌及非癌中的表达。细胞功能实验检测前列腺癌低表达ACACA细胞系功能及代谢组学变化。WB检测脂肪酸及酯类代谢途径相关蛋白表达。海马实验检测细胞系线粒体潜能及能量产生变化。流式细胞术和荧光显微镜检测线粒体染色情况。qRT-PCR检测线粒体DNA（mtDNA）。流式细胞术检测细胞活性氧（ROS）水平。比色法检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）水平。动物体内探讨ACACA对裸鼠肿瘤形成影响。结果1、ACACA在前列腺癌组织中高表达,临床TNM分期显示晚期PCa患者ACACA表达水平强于低级别患者。T3强于T2、T1,N1强于N0,M1强于M0,均有统计学差异。GEPIA统计显示前列腺癌患者中ACACA表达明显高于健康者。2、细胞功能实验显示,与对照组相比敲低ACACA基因后,DU145细胞和PC3细胞迁移能力,侵袭能力,增殖能力明显减弱,细胞周期G1期延长。均有统计学意义。3、代谢组学检测显示,敲低ACACA基因后,DU145细胞中有94种代谢物质发生改变,PC3细胞中105种物质发生改变,两种细胞中39种物质同时发生改变。ATP水平在两种细胞中均降低。PC3细胞中敲低ACACA基因后,脂肪酸代谢产物L-棕榈酰肉碱和硬脂肉碱水平减少,相关途径蛋白（FAS,Lipin1,ATP-CL,P-ATP-CL,AceCS1,ACSL1）水平下调。均有统计学意义。4、海马实验显示,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞中ATP产量,基础呼吸,最大呼吸,储存呼吸能力均下降。实时ATP检测中发现,DU145细胞总ATP产生率下降,线粒体ATP产生率显着下降。5、线粒体荧光染色显示,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞线粒体染色及平均荧光强度均减弱。DU145和PC3细胞mtDNA均明显降低。且均有统计学差异。6、NAD+/NADH检测发现,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞中该比值均上升,且细胞内ROS水平均高于对照组,均有统计学差异。7、裸鼠成瘤模型中,实验组肿瘤在各个时间点体积明显小于对照组,肿瘤重量也明显小于对照组,均有统计学差异。结论:ACACA基因的高表达与前列腺癌的TNM分期呈正相关。结果证实,前列腺癌细胞中ACACA的下调通过干扰NAD+/NADH,线粒体ATP产量,mtDNA和ROS水平的平衡而影响线粒体潜力,从而降低了肿瘤细胞的增殖能力。测试线粒体潜力和ACACA的表达可能会在将来成为预测目标和治疗方法。
于海滨[8]（2020）在《线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响》文中研究表明随着畜牧业的快速发展和人类生活水平的提高,消费者对牛乳品质的需求也逐渐增加,对乳品质的要求也越来越高。牛乳品质性状是复杂经济性状,多基因共同调控其表型变化。随着后基因组学时代的到来,筛查与挖掘奶牛乳脂性状相关且具有重大遗传效应的候选功能基因,成为当前奶牛遗传育种科研工作者的主要挑战。甘油-3-磷酸酰基转移酶线粒体（GPAM）基因,属于GPAT基因家族,该基因定位在牛第26q22号染色体上。有研究表明,GPAM基因催化磷脂和甘油三酯（TG）生物合成的第一步反应。基于课题组前期组学分析结果,GPAM基因可能对牛乳脂代谢具有重要影响。本研究以GPAM为候选基因,在敲除细胞水平验证目的基因与牛脂质代谢的功能,同时在模式动物的基础上,解析GPAM基因对乳脂代谢的调控作用机制。利用CRISPR-Cas9技术,以牛乳腺上皮细胞为研究对象,构建GPAM基因敲除细胞系,同时利用本课题组前期构建的GPAM基因过表达和干扰载体,分别检测目的基因过表达、干扰和敲除后,基因m RNA和蛋白水平的表达情况,检测细胞内甘油三酯、胆固醇和脂肪酸含量,并利用RT-q PCR和Western-blot技术,在m RNA和蛋白水平上验证GPAM基因对牛乳脂代谢相关基因的调控作用。研究结果表明:目的基因敲除后,细胞内GPAM在m RNA和蛋白水平的表达均降低;GPAM基因敲除细胞系内的甘油三酯和胆固醇的含量相对于野生型细胞均显着降低;细胞内脂肪酸含量检测结果显示:GPAM基因过表达能够降低细胞内丁酸的含量,沉默GPAM基因能够促进细胞内丁酸和辛酸含量显着升高;GPAM基因敲除能够促进辛酸的含量增加;乳脂代谢相关基因表达量的检测结果显示:敲除GPAM基因能够降低细胞内脂代谢相关基因ACSL5、FABP3、HSL、PRSS2、AGPAT4的表达,进而调控乳脂代谢通路。GPAM基因转录组测序共获得360个上调基因和570个下调基因;差异基因中的352个基因共富集在3196个GO terms,其中613个GO terms显着富集,包括402个生物过程的GO terms,72个细胞成分GO terms和139个分子功能GO terms;差异表达基因中共富集237个Pathway,其中139个Pathway显着富集（P<0.05）,下调基因富集在78个通路中,上调基因富集在61个通路中。GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析结果表明,GPAM敲除后在对糖代谢信号通路的作用,主要是通过影响丙酸（PATH:00640）和丙酮酸（PATH:00620）代谢通路,使其表达水平上调,提示GPAM基因可能对丙酸和丙酮酸起调控作用,从而对细胞内糖酵解产生一定的影响。同时在转录组测序结果中也发现GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。根据转录组的数据分析结果表明;GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。转录组数据分析发现,GPAM基因参与丙酸、丙酮酸代谢进程,该基因敲除后细胞内丙酸、丙酮酸代谢发生了变化,预测可能对线粒体能量代谢和糖酵解产生影响。同时,GPAM基因作为一种线粒体基因,研究其表达对细胞线粒体功能的影响具有重要意义,根据以上推断我们展开了敲除细胞内线粒体能量代谢的研究。以牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系为研究对象,研究GPAM基因敲除后细胞中线粒体数量、线粒体呼吸能力、线粒体糖酵解速率、细胞对ATP需求的变化。线粒体能量代谢实验结果表明:在GPAM基因敲除细胞系中,细胞内线粒体呼吸能力降低。同时,GPAM敲除后导致线粒体糖酵解所需的重要调节酶活性降低,从而最终导致细胞线粒体糖酵解过程受到显着抑制。同时影响了细胞内Na+/K+的转运;敲除GPAM基因后细胞内线粒体含量减少。实验表明,敲除细胞中GPAM含量的降低导致了细胞线粒体氧化磷酸化和三羧酸循环过程受到显着抑制。以上这些结果都说明,GPAM的敲除能够影响乳腺上皮细胞的线粒体能量代谢。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,建立GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上验证基因表达调控作用。结果表明:GPAM基因敲除小鼠的生长、发育和繁殖无明显的变化。血清学检测结果发现:GPAM基因敲除小鼠的血清中甘油三酯含量显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）,而血清中胆固醇的含量变化并不显着;组织中甘油三酯和胆固醇的检测结果发现:敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织中甘油三酯、胆固醇的含量均显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）;小鼠乳汁甘油三酯酶联免疫吸附实验结果显示:与野生鼠相比,GPAM基因敲除小鼠乳汁中的甘油三酯含量明显降低（p<0.05）;组织形态学观察表明,敲除小鼠脂肪组织中脂肪细胞的胞体直径略小于野生型小鼠,肌间脂肪含量明显少于与野生型小鼠,乳腺组织中野生型小鼠的脂肪细胞的直径略大于敲除型小鼠,其他组织无明显形态学变化;乳腺组织的脂肪酸含量检测结果显示:敲除小鼠乳腺组织中肉豆蔻酸、棕榈硬脂酸、花生四烯酸盐和亚麻酸盐上显着高于野生型小鼠。本研究在前期转录组学分析的基础上,以GPAM为候选基因,在敲除细胞系水平上验证GPAM基因对细胞内脂肪酸、甘油三酯、胆固醇含量的影响,并对GPAM基因敲除细胞系进行转录组分析,解析该基因敲除后对乳脂代谢相关基因的分子机制;同时检测了敲除GPAM基因乳腺上皮细胞内线粒体活性及能量代谢改变情况,阐明GPAM基因是参与线粒体能量代谢的重要基因,并对糖酵解产生影响;构建了GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上进一步验证GPAM基因对乳脂代谢的调控作用。为奶牛乳脂性状的改良和新品种的培育提供优质的基因资源和理论基础。
黄橙[9]（2020）在《基于PCR array技术探究AMPK信号通路对蛋鸡原代肝细胞脂肪变性的调控作用》文中研究表明为了研究AMPK信号通路对蛋鸡原代肝细胞脂肪变性的调控作用,本研究选取34-40周龄的海兰褐蛋鸡,通过原位二步灌流法建立蛋鸡肝细胞体外培养模型,利用1m M的油酸/棕榈酸（2:1）高脂培养液处理肝细胞构建脂肪变性模型。试验分为两组,分别为CK组（0m M油酸/棕榈酸）和FFA组（1m M油酸/棕榈酸）,造模24h。随后检测蛋鸡原代肝细胞ICelligence系统下的细胞增殖活性;利用油红O染色观察脂质蓄积情况、糖原染色观察糖原含量变化;通过生化检测试剂盒测定细胞中脂质相关指标（TC、TG）、上清液葡萄糖含量（GLU）、氧化还原相关指标（SOD、T-AOC、MDA）;通过吖啶橙/溴化乙锭染色,观察细胞凋亡情况;通过流式细胞仪测定细胞活性氧水平、细胞线粒体膜电位变化;基于PCR array技术测定AMPK信号通路中84个基因的m RNA表达量;此外,针对关键基因和蛋白（P-AMPK、ACC、P-ACC、AKT、Caspase-3、INSR）进行验证实验。结果如下:1.与CK组比较,FFA组发现大量脂质蓄积、糖原含量明显减少;ICelligence系统测定结果显示FFA组细胞增殖能力较CK组有所降低,但两组细胞活性没有显着差异（P>0.05）。2.与CK组比较,FFA组细胞中TG、TC、MDA含量显着或极显着上升（P<0.05或P<0.01）,SOD和T-AOC的含量极显着下降（P<0.01）,细胞上清液中GLU含量极显着下降（P<0.01）。3.与CK组比较,FFA组细胞凋亡率、细胞活性氧极显着上升;线粒体膜电位水平极显着下降（P<0.01）。4.与CK组比较,FFA组AMPK信号通路中的FASN、ACACB、ADRA2A、ADRA2C、HMGCS1、PFKFB3、PFKFB4、m TOR、TXNIP、FOXO3、TSC1、TSC2和TP53的m RNA的表达量显着或极显着上调（P<0.05或P<0.01）,CRTC1、CPT2、CPT1A、INSR、AKT1、PPARGC1B和CAMKK2的m RNA的表达量显着或极显着下调（P<0.05或P<0.01）。5.与CK组比较,FFA组细胞的P-AMPK、P-ACC蛋白表达极显着下（P<0.01）;ACC、Caspase 3蛋白表达显着上升（P<0.05）;AKT、INSR蛋白表达呈下降趋势（P>0.05）。结论:蛋鸡原代肝细胞在脂肪变性的影响下,AMPK信号通路中FASN、ACACB、ADRA2A等基因量显着上调,CRTC1、CPT2、CPT1A等基因表达量显着下调,造成脂质、碳水化合物代谢紊乱,形成氧化损伤和细胞周期的改变。
曹菲[10]（2019）在《维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究》文中提出心肌致密化不全（non-compaction of ventricular myocardium,NVM）又称之为心室肌小梁过多、海绵状心肌,是一种特殊类型的心肌病,由薄而致密的心外膜下心肌层和增厚的非致密的心内膜下心肌层的双层心肌构成,且非致密化心内膜下心肌层表面可见多个显着突起的肌小梁和小梁间深凹的隐窝与心室腔相通并有血流进出。本文第一章对NVM的命名、流行病学、分类、病因和发病机制、病理解剖学、病理生理学和临床表现、临床诊断与鉴别诊断、治疗及其预后等国内外研究进展进行系统性综述。因NVM具有发病率高、病因不明、无有效治疗方法,死亡率高及预后差等特点,故通过建立NVM动物模型揭示其发病机制具有重要科学价值和临床价值。本课题主要针对维甲酸（retinoic acid,RA）诱导NVM小鼠模型并进行相关基础研究。研究内容分为三部分:1.探讨如何运用RA诱导孕鼠子代建立NVM小鼠模型;2.在成功建立NVM小鼠模型后,运用等重同位素多标签相对定量蛋白质组学（tandem mass tag,TMT）检测NVM心脏组织差异蛋白;3.运用平行反应监测（parallel reaction monitoring,PRM）技术对NVM差异蛋白进行验证和定量分析,进而发现潜在的与NVM发生相关蛋白,为后续蛋白功能验证、探索NVM相关发病机制以及潜在治疗靶点的可能性提供研究基础。第一部分:根据前期关于精确浓度RA与正常胚胎心肌致密化发育过程密切相关的研究报告,提出了采用过量RA干扰孕鼠胚胎心肌致密化过程而诱导孕鼠子代建立NVM模型的假设。本研究在孕鼠怀孕第8.5天给予全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）70mg/kg诱导孕鼠胎儿NVM。组织病理学证实RA干预组孕鼠子代表现出典型的NVM病理学特征。研究中进一步发现与对照组相比,RA干预组孕鼠子代平均体重明显减低,显示统计学显着差异（P<0.0001）。给予ATRA10天后母鼠平均体重较给药前明显下降,表现出显着的统计学差异（P<0.0001）。结论:过量的ATRA可诱导孕鼠子代建立NVM幼鼠模型,并提示过量的ATRA可能参与母鼠及其子代能量代谢过程。该动物模型为下一步TMT相对定量蛋白质组学检测NVM心脏组织建立基础。第二部分:在RA诱导孕鼠子代建立NVM幼鼠模型后,运用TMT相对定量蛋白质组学技术开展RA诱导NVM的基础研究。在RA干预组（RA）与空白对照组（Control）进行差异表达蛋白筛选,发现差异蛋白68个;在RA干预组（RA）与DMSO对照组（DMSO）进行差异表达蛋白筛选,发现差异蛋白48个。经过基因本体（Gene Ontology,GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析发现,RA与两个对照组的共同差异表达蛋白及其通路主要表现在能量代谢和凝血功能方面。结论:根据已有大量此类蛋白功能相关研究,初步推测RA诱导孕鼠子代NVM与能量代谢异常相关的可能性较大,而NVM心室内血栓形成与凝血功能异常相关的可能性较大,其具体致病机制尚待进一步研究。第三部分:在TMT相对定量蛋白质组学检测NVM心脏组织进行差异表达蛋白筛选和分析之后,运用PRM技术对差异蛋白进行验证和定量分析。分别对Control、DMSO以及RA三组中9例幼鼠心脏样品中6种差异蛋白激肽原1（kininogen-1,KNG1）、α1抗胰蛋白酶（alpha-1-antitrypsin,A1AT）、载脂蛋白 A1（apolipoproteinA-I,ApoAI）、β2 糖蛋白 1（beta-2-glycoprotein1,β2GP1）、微管蛋白β4a 链（tubulinbeta-4Achain,TUBB4A）、水通道蛋白4（aquaporin-4,AQP4）的 12条肽段进行PRM定量分析,结果表明:这6种蛋白的表达与TMT检测的相对定量结果一致,存在显着差异。对这6种蛋白的结构、功能及所在相关通路以及与NVM可能的相关性进行分析总结,将为后续NVM相关蛋白功能验证,了解NVM相关发病机制及靶向治疗提供进一步的研究方向。
二、LYSOPHOSPHATIDIC ACID ACTIVATES NUCLEAR NUCLEOSIDE TRIPHOSPHATASE IN RAT HEPATOCYTES（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、LYSOPHOSPHATIDIC ACID ACTIVATES NUCLEAR NUCLEOSIDE TRIPHOSPHATASE IN RAT HEPATOCYTES（论文提纲范文）
（1）5-甲氧基色氨酸经FOXO3a/miR-21/ATG5信号通路调控自噬抗肝纤维化作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 肝纤维化概述 |
| 1.2 肝纤维化的发病机制 |
| 1.2.1 肝细胞的坏死或凋亡是肝纤维化发生的初始事件 |
| 1.2.2 肝星状细胞活化是肝纤维化发生的关键环节 |
| 1.2.3 其他来源的肌成纤维细胞对肝纤维化的调控作用 |
| 1.2.4 细胞外基质对肝纤维化的促进作用 |
| 1.2.5 miRNA与肝纤维化 |
| 1.2.6 自噬与肝纤维化 |
| 1.3 肝纤维化的药物治疗研究进展 |
| 1.3.1 针对肝损伤病因的药物在肝纤维化治疗中的研发进展 |
| 1.3.2 抑制肝细胞凋亡药物在肝纤维化治疗中的研发进展 |
| 1.3.3 抑制肝细胞炎症药物在肝纤维化治疗中的研发进展 |
| 1.3.4 抑制肌成纤维细胞活化药物在肝纤维化治疗中的研发进展 |
| 1.4 5-甲氧基色氨酸与纤维化 |
| 1.5 设计思路与研究内容 |
| 第二章 5-甲氧基色氨酸对四氯化碳所致大鼠肝纤维化的保护作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计分析方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 5-MTP影响四氯化碳所致大鼠肝纤维化的组织形态学 |
| 2.3.2 5-MTP影响四氯化碳所致大鼠肝纤维化组织胶原纤维的沉积 |
| 2.3.3 5-MTP影响四氯化碳所致大鼠肝组织α-SMA蛋白表达 |
| 2.3.4 5-MTP影响四氯化碳所致大鼠肝纤维组织Fibronectin、Collagen I、Collagen III蛋白表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 5-甲氧基色氨酸抑制肝星状细胞增殖和活化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 统计方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 高浓度5-MTP对肝星状细胞的抑制作用 |
| 3.3.2 5-MTP抑制活化的肝星状细胞增殖 |
| 3.3.3 5-MTP抑制活化的肝星状细胞纤维化相关基因m RNA表达 |
| 3.3.4 5-MTP抑制活化的肝星状细胞纤维化相关基因蛋白表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 5-甲氧基色氨酸通过激活自噬抑制肝星状细胞增殖和活化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 统计分析方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 5-MTP激活CCl_4诱导的大鼠肝组织自噬 |
| 4.3.2 5-MTP激活活化的肝星状细胞自噬 |
| 4.3.3 3-MA可逆转5-MTP干预的自噬增加 |
| 4.3.4 5-MTP通过激活自噬抑制肝星状细胞增殖 |
| 4.3.5 5-MTP通过激活自噬抑制肝星状细胞纤维化相关基因表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 5-甲氧基色氨酸通过调控FOXO3a/miR-21/ATG5信号通路诱导的自噬抑制肝星状细胞的增殖和活化 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.3 统计分析方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 5-MTP上调FOXO3a的表达水平、抑制miR-21的转录 |
| 5.3.2 miR-21靶向调控ATG5基因 |
| 5.3.3 5-MTP通过调控FOXO3a/miR-21/ATG5信号通路诱导自噬 |
| 5.3.4 5-MTP通过调控FOXO3a/miR-21/ATG5信号通路诱导自噬抑制肝星状细胞增殖 |
| 5.3.5 5-MTP通过调控FOXO3a/miR-21/ATG5信号通路诱导自噬抑制肝星状细胞活化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 总结与研究展望 |
| 6.1 主要研究结果 |
| 6.2 研究创新点 |
| 6.3 研究不足及展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩写词对照表 |
| 附录二 攻读学位期间主要的研究成果 |
| 致谢 |
（2）环丙烯类脂肪酸对蛋鸡肝脏脂质代谢和蛋品质的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 Abbreviated words |
| 第一章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 棉粕和棉油的资源与利用 |
| 2.1 棉粕和棉油的资源现状及其营养价值 |
| 2.2 棉粕和棉油在生产中的利用 |
| 3 棉粕和棉油中主要抗营养因子 |
| 3.1 棉酚 |
| 3.2 环丙烯类脂肪酸 |
| 3.3 其他抗营养因子 |
| 4 禽类脂质代谢 |
| 4.1 脂质的分类 |
| 4.2 家禽肝脏脂质的合成与转运 |
| 4.3 蛋黄脂质的转运和沉积 |
| 4.4 蛋禽脂质代谢紊乱 |
| 4.5 日粮因素对脂质代谢的影响 |
| 5 鸡蛋的品质与构成 |
| 5.1 鸡蛋的结构和组成 |
| 5.2 鸡蛋品质及其影响因素 |
| 6 选题依据与研究内容 |
| 6.1 选题依据 |
| 6.2 研究内容 |
| 6.3 技术路线 |
| 第二章 日粮中棉粕和棉油对蛋鸡脂质组成的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要仪器及设备 |
| 2.1.2 主要试剂及配制 |
| 2.2 试验设计及日粮处理 |
| 2.3 试验动物饲养管理 |
| 2.4 样品采集及指标测定的方法 |
| 2.4.1 样品采集 |
| 2.4.2 生产性能的测定 |
| 2.4.3 脏器指数及肝脏组织切片制作及观察 |
| 2.4.4 血清抗氧化指标的测定 |
| 2.4.5 组织常规养分含量的测定 |
| 2.4.6 脂肪酸组成的测定 |
| 2.4.7 胆固醇含量的测定 |
| 2.4.8 棉酚残留的测定 |
| 2.5 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 蛋鸡生产性能 |
| 3.2 蛋鸡脏器的指数及肝脏组织结构的观察 |
| 3.2.1 脏器指数 |
| 3.2.2 肝脏组织结构的观察 |
| 3.3 蛋鸡血清抗氧化能力 |
| 3.4 蛋鸡肌肉常规营养成分 |
| 3.4.1 胸肌常规营养成分含量 |
| 3.4.2 腿肌常规营养成分含量 |
| 3.5 蛋鸡组织中脂肪酸的组成及胆固醇含量 |
| 3.5.1 胸肌脂肪酸组成 |
| 3.5.2 腿肌脂肪酸组成 |
| 3.5.3 肝脏脂肪酸组成 |
| 3.5.4 腹脂脂肪酸组成 |
| 3.5.5 胆固醇含量 |
| 3.6 蛋鸡肌肉中棉酚残留量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 棉粕和棉油对蛋鸡生产性能的影响 |
| 4.2 棉粕和棉油对蛋鸡脏器指数及肝脏组织结构的影响 |
| 4.3 棉粕和棉油对蛋鸡血清抗氧化指标的影响 |
| 4.4 棉粕和棉油对鸡肉和肝脏中脂质成分的影响 |
| 4.5 蛋鸡脂质代谢变化的原因分析 |
| 5 小结 |
| 第三章 环丙烯类脂肪酸和棉酚对蛋鸡生产性能和肝脏脂质代谢的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要化学试剂 |
| 2.2 试验设计与日粮处理 |
| 2.3 试验动物饲养管理 |
| 2.4 样品采集及指标测定方法 |
| 2.4.1 样品采集 |
| 2.4.2 生产性能的测定 |
| 2.4.3 血清生化指标的测定 |
| 2.4.4 透射电镜观察 |
| 2.4.5 血清和肝脏中脂质成分的测定 |
| 2.4.6 EOFT测血细胞渗透脆性 |
| 2.4.7 红细胞膜脂肪酸组成测定 |
| 2.4.8 血液红细胞参数测定 |
| 2.4.9 肝脏RNA的提取和q-PCR定量 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 蛋鸡生产性能 |
| 3.2 蛋鸡脏器指数 |
| 3.3 蛋鸡血清生化和抗氧化指标 |
| 3.4 蛋鸡肝脏组织学观察和细胞结构 |
| 3.5 蛋鸡肝脏和血清脂质含量 |
| 3.6 蛋鸡肝脏脂肪酸组成 |
| 3.7 蛋鸡红细胞膜脂肪酸组成及红细胞渗透脆性 |
| 3.8 蛋鸡血液红细胞参数 |
| 3.9 蛋鸡肝脏脂质代谢相关基因表达量 |
| 3.9.1 肝脏脂肪酸合成相关基因表达量 |
| 3.9.2 肝脏脂质组装和转运相关基因表达量 |
| 3.9.3 肝脏胆固醇代谢相关基因表达量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 棉酚和CPFAs对蛋鸡生产性能的影响 |
| 4.2 棉酚和CPFAs对蛋鸡肝脏健康的影响 |
| 4.2.1 棉酚和CPFAs对蛋鸡脏器指数和肝脏组织结构的影响 |
| 4.2.2 棉酚和CPFAs对蛋鸡脏血清生化及抗氧化能力的影响 |
| 4.3 棉酚和CPFAs对蛋鸡肝脏脂质代谢的影响 |
| 4.4 棉酚和CPFAs对蛋鸡血液红细胞相关参数的影响 |
| 5 小结 |
| 第四章 多组学解析环丙烯类脂肪酸致蛋鸡肝脏脂质代谢紊乱的机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.2 试验设计 |
| 2.3 肝脏脂质组分析 |
| 2.4 肝脏转录组测序 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 蛋鸡肝脏脂质组分析 |
| 3.1.1 蛋鸡肝脏脂质主成分分析结果 |
| 3.1.2 蛋鸡肝脏脂质偏最小二乘法-判别分析结果 |
| 3.1.3 蛋鸡肝脏不同种类脂质成分含量的比较 |
| 3.1.4 蛋鸡肝脏甘油酯的变化 |
| 3.1.5 蛋鸡肝脏磷脂的变化 |
| 3.2 蛋鸡肝脏转录组分析 |
| 3.2.1 蛋鸡肝脏转录组差异表达的基因 |
| 3.2.2 蛋鸡肝脏DEGs的 COGs功能分类 |
| 3.2.3 蛋鸡肝脏DEGs的 GO功能分析和KEGG信号通路分析 |
| 3.3 蛋鸡肝脏甘油酯和磷脂代谢通路 |
| 4 讨论 |
| 4.1 蛋鸡肝脏脂质代谢物变化 |
| 4.2 肝脏基因转录水平变化 |
| 5 小结 |
| 第五章 鸡蛋储藏条件在橡皮蛋形成中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 样品采集及指标的测定方法 |
| 2.3.1 样品的采集与处理 |
| 2.3.2 蛋品质的测定 |
| 2.3.3 蛋黄物理性状的测定 |
| 2.3.4 蛋黄微观结构观察 |
| 2.3.5 水分分析和pH的测定 |
| 2.3.6 蛋黄重量和蛋黄指数 |
| 2.3.7 蛋黄脂肪酸组成、胆固醇含量和棉酚残留的测定 |
| 2.4 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸡蛋常规品质 |
| 3.2 鸡蛋蛋黄脂肪酸组成 |
| 3.3 鸡蛋蛋黄胆固醇含量 |
| 3.4 鸡蛋蛋黄棉酚残留 |
| 3.5 熟蛋黄质构特性 |
| 3.6 熟蛋黄切面和微观结构 |
| 3.7 不同温度条件下储藏后蛋黄质构特性的变化 |
| 3.8 不同温度条件下储藏后蛋黄黏性的变化 |
| 3.9 不同温度条件下储藏后蛋黄常规物理化学指标的变化 |
| 3.10 不同温度条件下储藏后蛋黄和蛋清外观的变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 棉酚和CPFAs对鸡蛋常规品质的影响 |
| 4.2 棉酚和CPFAs对蛋黄脂肪酸和胆固醇含量的影响 |
| 4.3 棉酚和CPFAs对蛋黄棉酚残留的影响 |
| 4.4 棉酚和CPFAs对熟蛋黄物理特性和微观结构的影响 |
| 4.5 橡皮蛋物理化学特性在储藏过程中的变化 |
| 5 小结 |
| 第六章 L-半胱氨酸和大豆磷脂缓解橡皮蛋的形成及CPFAs肝脏脂质毒性的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 动物试验 |
| 2.3 样品采集 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸡蛋常规品质 |
| 3.2 鸡蛋蛋黄脂肪酸组成和胆固醇含量 |
| 3.3 鸡蛋蛋黄物理特性 |
| 3.4 蛋鸡肝脏和血清脂质含量 |
| 3.5 蛋鸡肝脏组织学观察 |
| 3.6 蛋鸡血清生化指标 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 在读期间发表的论文情况 |
| 致谢 |
（3）P2X7受体在镉致小鼠骨质疏松中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 镉对骨细胞毒性机制的研究进展 |
| 1 镉对骨骼系统的毒性机理研究 |
| 1.1 镉对骨髓间充质干细胞的毒性作用 |
| 1.2 镉对成骨细胞的毒性作用 |
| 1.3 镉对破骨细胞的毒性作用 |
| 1.4 镉对软骨细胞的毒性作用 |
| 1.5 镉对骨细胞的毒性作用 |
| 2 小结 |
| 第二章 骨质疏松症的研究进展 |
| 1 骨质疏松症的发病机制 |
| 1.1 成骨细胞 |
| 1.2 破骨细胞 |
| 1.3 骨细胞 |
| 2 小结 |
| 第三章 P2X7受体在骨生物学中的作用 |
| 1 P2X7受体与骨细胞的关系 |
| 1.1 P2X7受体与破骨细胞 |
| 1.2 P2X7受体与成骨细胞 |
| 1.3 P2X7受体与骨细胞 |
| 2 小结 |
| 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 镉对小鼠成骨细胞和破骨细胞分化及凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和细胞株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 细胞培养 |
| 1.5 碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色 |
| 1.6 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 |
| 1.7 破骨细胞骨吸收能力的检测 |
| 1.8 免疫荧光观察F-actin的大小和整合素的分布及表达 |
| 1.9 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 1.10 CCK-8法检测细胞存活率 |
| 1.11 Western blot检测相关蛋白的表达 |
| 1.12 qRT-PCR检测mRNA的转录 |
| 1.13 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 长时间镉暴露对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响 |
| 2.1.1 长时间镉暴露对骨髓间充质干细胞成骨过程中ALP活力和矿化结节的影响 |
| 2.1.2 长时间镉暴露对骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因和蛋白表达的影响 |
| 2.2 长时间镉暴露对破骨细胞分化的影响 |
| 2.3 短时间镉暴露对成骨细胞和破骨细胞凋亡的影响 |
| 2.3.1 短时间镉暴露对成骨细胞和破骨细胞存活率的影响 |
| 2.3.2 短时间镉暴露对成骨细胞和破骨细胞凋亡率的影响 |
| 2.3.3 短时间镉暴露对成骨细胞和破骨细胞凋亡及自噬的影响 |
| 2.4 短时间镉暴露对破骨细胞分化和黏附性的影响 |
| 2.4.1 短时间镉暴露对破骨细胞分化的影响 |
| 2.4.2 短时间镉暴露对破骨细胞黏附结构的影响 |
| 3 讨论 |
| 第二章 P2X7受体在镉致成骨细胞和破骨细胞分化中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和细胞株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 细胞培养 |
| 1.5 碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色 |
| 1.6 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 |
| 1.7 破骨细胞骨吸收能力的检测 |
| 1.8 免疫荧光观察P2X7受体的表达 |
| 1.9 细胞转染 |
| 1.10 ELIAS试剂盒检测ATP活性 |
| 1.11 Western blot检测相关蛋白的表达 |
| 1.12 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 长时间镉暴露对P2X7/PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 2.2 P2X7受体对成骨细胞和破骨细胞分化的影响 |
| 2.3 P2X7受体在镉致成骨细胞和破骨细胞分化中的作用 |
| 2.4 P2X7/PI3K/AKT信号在镉致成骨细胞和破骨细胞分化中的作用 |
| 3 讨论 |
| 第三章 镉对小鼠骨质疏松发病机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 MicroCT分析 |
| 1.5 骨组织H&E、TRAP和ALP染色 |
| 1.6 免疫组织化学检测骨组织中关键蛋白的变化 |
| 1.7 Western blot检测骨组织中关键蛋白的表达 |
| 1.8 骨组织中ATP含量的检测 |
| 1.9 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 镉对小鼠骨骼微观结构的影响 |
| 2.2 镉对小鼠骨组织病理变化的影响 |
| 2.3 镉对小鼠骨组织中成骨和破骨相关蛋白表达的影响 |
| 2.4 镉对小鼠骨组织中凋亡和自噬相关蛋白表达的影响 |
| 2.5 镉对小鼠骨组织中P2X7/PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简历攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）基于UPLC-MS/MS的股骨头坏死骨组织外泌体代谢组学分析（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 外泌体在股骨头坏死中的调节作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（5）基于多组学策略研究蟾酥中活性成分对肝癌的治疗作用及其机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 肝癌的研究进展 |
| 1.1.1 肝癌的发病 |
| 1.1.2 肝癌的治疗 |
| 1.1.3 肝癌与肠道微生态 |
| 1.2 蟾酥的研究进展 |
| 1.2.1 蟾酥的本草考证 |
| 1.2.2 蟾酥的资源分布 |
| 1.2.3 蟾酥的化学成分及质量评价 |
| 1.2.4 蟾酥的药理作用及其作用机制 |
| 1.3 药物联用的研究现状 |
| 1.3.1 药物相互作用 |
| 1.3.2 中药联用的研究现状 |
| 1.4 多组学策略的研究进展及应用 |
| 1.4.1 代谢组学研究 |
| 1.4.2 脂质组学研究 |
| 1.4.3 肠道微生物组学研究 |
| 1.5 本文的研究思路和内容 |
| 2 蟾酥中活性成分在肝癌治疗中的相互作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 蟾毒灵、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基用于肝癌治疗的相互作用 |
| 2.2.1 实验部分 |
| 2.2.2 结果与讨论 |
| 2.3 蟾毒灵与华蟾酥毒基联用对荷瘤小鼠的治疗作用 |
| 2.3.1 实验部分 |
| 2.3.2 结果与讨论 |
| 2.4 本章总结 |
| 3 蟾毒灵及华蟾酥毒基联用治疗肝癌的代谢组学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 仪器、材料与试剂 |
| 3.2.2 细胞培养及分组 |
| 3.2.3 代谢物的提取 |
| 3.2.4 质控样品及空白样品的制备 |
| 3.2.5 代谢组学分析 |
| 3.2.6 数据处理与统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 不同处理组间的代谢物表征 |
| 3.3.2 差异代谢物筛选 |
| 3.3.3 通路分析 |
| 3.4 本章总结 |
| 4 蟾毒灵及华蟾酥毒基联用治疗肝癌的脂质组学及质谱成像研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 仪器、材料与试剂 |
| 4.2.2 细胞培养及分组 |
| 4.2.3 脂质提取 |
| 4.2.4 质控样品及空白样品的制备 |
| 4.2.5 脂质组学分析 |
| 4.2.6 数据处理与统计分析 |
| 4.2.7 肿瘤组织切片制备 |
| 4.2.8 肿瘤组织H&E染色 |
| 4.2.9 MALDI-MSI分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 不同处理组间的脂质表征 |
| 4.3.2 差异脂质标志物筛选 |
| 4.3.3 通路分析 |
| 4.3.4 肿瘤的异质性 |
| 4.3.5 脂质标志物的可视化及在肿瘤中的定位 |
| 4.4 本章总结 |
| 5 基于代谢组学与脂质组学的生物学验证 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 仪器、材料与试剂 |
| 5.2.2 线粒体膜电位测定 |
| 5.2.3 能量代谢分析 |
| 5.2.4 氧化应激指标测定 |
| 5.2.5 关键基因表达的检测 |
| 5.2.6 统计学处理 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 蟾毒灵与华蟾酥毒基联用对线粒体膜电位的影响 |
| 5.3.2 蟾毒灵与华蟾酥毒基联用对癌细胞能量代谢的影响 |
| 5.3.3 氧化应激指标的测定 |
| 5.3.4 关键基因的表达 |
| 5.4 本章总结 |
| 6 蟾毒灵及华蟾酥毒基联用治疗肝癌的肠道微生物组学研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 仪器、材料与试剂 |
| 6.2.2 肠道微生物组学研究 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 可操作分类单元(Operational Taxonomic Unit,OTU)分析 |
| 6.3.2 α多样性分析 |
| 6.3.3 β多样性分析 |
| 6.3.4 蟾毒灵与华蟾酥毒基联用对小鼠肠道微生物相对丰度的影响 |
| 6.3.5 蟾毒灵与华蟾酥毒基联用对小鼠肠道微生物组成的影响 |
| 6.4 本章总结 |
| 7 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历及攻读博士学位期间科研成果 |
（6）基于肥大细胞调控肥胖和能量代谢的机制研究白杨素干预高脂饮食相关代谢性疾病的作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肥胖、能量代谢和营养摄入 |
| 1.1.1 肥胖的定义、流行和危害 |
| 1.1.2 能量代谢 |
| 1.1.3 营养摄入 |
| 1.2 能量代谢与脂肪组织棕色化 |
| 1.2.1 脂肪细胞类型和分布 |
| 1.2.2 脂肪细胞的发育起源 |
| 1.2.3 促进脂肪组织棕色化的因素 |
| 1.3 免疫细胞与能量代谢以及肥胖的关系 |
| 1.3.1 免疫细胞与脂肪组织炎性 |
| 1.3.2 免疫细胞与脂肪组织产热 |
| 1.4 MC研究进展 |
| 1.4.1 MC简介 |
| 1.4.2 MC的激活 |
| 1.4.3 MC分泌的介质 |
| 1.4.4 MC参与多种代谢性疾病 |
| 1.5 MC稳定剂及其生物活性 |
| 1.5.1 人工合成的MC稳定剂 |
| 1.5.2 天然MC稳定剂 |
| 1.5.3 食品源MC稳定剂白杨素研究进展 |
| 1.6 研究背景以及拟解决的关键科学问题 |
| 1.6.1 研究背景 |
| 1.6.2 拟解决的关键科学问题 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与实验材料 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 饲料配制 |
| 2.3.2 小鼠饲养和饮食 |
| 2.3.3 细胞培养 |
| 2.3.4 小鼠葡萄糖耐受(GTT)以及胰岛素耐受(ITT)试验 |
| 2.3.5 血浆脂蛋白以及脂肪组织中脂质的检测 |
| 2.3.6 组胺和β-己糖胺酶检测 |
| 2.3.7 组织脱水包埋切片 |
| 2.3.8 甲苯胺蓝染色 |
| 2.3.9 HE染色 |
| 2.3.10 UCP1免疫组化染色 |
| 2.3.11 UCP1与PDGFRα免疫荧光共定位染色 |
| 2.3.12 小鼠能量代谢检测 |
| 2.3.13 小鼠体温的检测 |
| 2.3.14 组织和细胞的总RNA提取及逆转录 |
| 2.3.15 定量PCR(Real-time PCR) |
| 2.3.16 组织总蛋白提取 |
| 2.3.17 Western blot |
| 2.3.18 脂肪组织中5-羟色胺的提取和检测 |
| 2.3.19 流式细胞仪分析 |
| 2.4 数据处理与分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 MC在饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗发生中的作用 |
| 3.1.1 MC稳定剂DSCG不减少普通高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗 |
| 3.1.2 MC稳定剂DSCG和酮替芬能减少高胆固醇西方饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗 |
| 3.1.3 MC稳定剂DSCG和酮替芬能够减轻高胆固醇高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗 |
| 3.1.4 饮食中摄入的Cho影响MC的激活 |
| 3.1.5 MC稳定剂会抑制LDL诱导的MC脱颗粒 |
| 3.2 MC调控机体脂肪组织棕色化和能量消耗的作用机制 |
| 3.2.1 MC失功能会增强小鼠能量消耗 |
| 3.2.2 Kit~(w-sh/w-sh)小鼠SAT中回复MC会抑制能量消耗降低产热 |
| 3.2.3 MC直接抑制脂肪细胞产热和棕色分化 |
| 3.2.4 MC通过分泌5-羟色胺(5-hydroxytryptamine)调节SAT棕色化和产热 |
| 3.3 食品源MC稳定剂白杨素干预小鼠DIO和能量消耗作用机制 |
| 3.3.1 白杨素改善HFD诱导的肥胖和胰岛素抵抗 |
| 3.3.2 白杨素减少高脂饮食喂养的小鼠体内脂肪过多 |
| 3.3.3 白杨素增强HFD喂养的小鼠能量消耗激活产热基因的表达 |
| 3.3.4 白杨素通过激活PDGFRα表达促进SAT浅棕色脂肪组织分化 |
| 3.3.5 白杨素激活SAT中PDGFRα的表达 |
| 3.3.6 白杨素影响骨髓来源巨噬细胞极化 |
| 3.3.7 白杨素通过miR调节SAT棕色化 |
| 3.3.8 结论 |
| 第四章 讨论、展望与创新点 |
| 4.1 讨论与展望 |
| 4.1.1 MC在饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗发生中的作用 |
| 4.1.2 MC调控机体脂肪组织棕色化和能量消耗的作用机制 |
| 4.1.3 食品源MC稳定剂白杨素干预小鼠饮食诱导肥胖和能量消耗的作用 |
| 4.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术活动及成果情况 |
（7）下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词简表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 前列腺癌概述 |
| 1.2 肿瘤细胞能量代谢改变 |
| 1.3 脂代谢与肿瘤 |
| 1.4 ACACA的一般特点 |
| 1.5 ACACA的功能区划分 |
| 1.6 ACACA的生理功能 |
| 1.6.1 ACACA的生理功能 |
| 1.6.2 ACACB的生理功能 |
| 1.7 ACACA调控肿瘤的分子机制及相关信号通路 |
| 1.7.1 ACACA调控肿瘤的分子机制 |
| 1.7.2 肿瘤中ACACA相关信号通路 |
| 1.8 靶向ACACA基因在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.8.1 TOFA |
| 1.8.2 ND-630 |
| 1.8.3 ND-646 |
| 1.8.4 BAY ACC002 |
| 1.8.5 ACACA活性的新型调节剂 |
| 1.9 ACACA与脂代谢在肿瘤细胞中的调节 |
| 1.9.1 阻止脂肪酸合成 |
| 1.9.2 阻断脂肪酸合成基因的表达 |
| 1.9.3 增加脂肪酸降解 |
| 1.9.4 将脂肪酸转移到储存中或阻止脂肪酸从储存中释放 |
| 1.10 目前ACACA在肿瘤中的研究现状 |
| 1.10.1 ACACA在头颈细胞癌中的研究 |
| 1.10.2 ACACA在非小细胞肺癌中的研究 |
| 1.10.3 ACACA在乳腺癌中的研究 |
| 1.10.4 ACACA与p-ACACA在乳腺癌中的研究 |
| 1.10.5 ACACA在胃癌中的研究 |
| 1.10.6 ACACA在肝癌中的研究 |
| 1.10.7 ACACA在前列腺癌中的研究 |
| 1.11 本研究拟解决的问题 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 前列腺癌患者组织芯片 |
| 2.1.2 实验细胞株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂和耗材 |
| 2.1.5 实验主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫组织化学实验及评分方法 |
| 2.2.2 细胞培养冻存和复苏 |
| 2.2.3 载体设计和细胞系构建 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.2.5 免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.6 细胞功能实验 |
| 2.2.7 液相色谱-质谱检测(LC-MS)细胞代谢组学检测 |
| 2.2.8 海马线粒体压力检测 |
| 2.2.9 海马XF-ATP效率实时检测 |
| 2.2.10 海马XF糖酵解速率检测 |
| 2.2.11 荧光显微镜及流式细胞术检测线粒体示踪 |
| 2.2.12 比色法检测NAD+/NADH水平 |
| 2.2.13 流式细胞术检测细胞内活性氧水平 |
| 2.2.14 动物实验构建裸鼠肿瘤模型 |
| 2.2.15 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 ACACA在前列腺癌组织中上调其表达与TNM分期有关 |
| 3.2 ACACA基因低表达的前列腺癌细胞系(DU145和PC3)构建 |
| 3.3 敲低ACACA基因抑制前列腺癌细胞(DU145和PC3)功能 |
| 3.4 ACACA基因对前列腺癌细胞(DU145和PC3)凋亡的影响 |
| 3.5 抑制ACACA基因影响DU145和PC3细胞ATP水平 |
| 3.6 PC3细胞中敲低ACACA基因后降低L-棕桐酰肉碱和硬脂肉碱水平及代谢途径相关蛋白表达 |
| 3.7 敲低前列腺癌细胞系ACACA基因抑制线粒体-ATP水平和线粒体潜能 |
| 3.8 ACACA能影响线粒体MTDNA及染色情况 |
| 3.9 ACACA基因影响前列腺癌细胞系NAD+/NADH比值和ROS水平 |
| 3.10 敲低ACACA基因后将抑制裸鼠皮下移植瘤形成 |
| 第四章 讨论 |
| 结论 |
| 本研究的不足之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 31种肿瘤简称 |
| 博士研究生期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 GPAM基因的研究进展 |
| 1.1 GPAM基因家族基因 |
| 1.2 GPAM基因的生物学作用 |
| 1.3 线粒体GPAM的功能 |
| 1.4 酵母中的GPAT表达 |
| 1.5 GPAM在甘油三酯合成中的调控作用 |
| 1.6 结语 |
| 第二章 影响乳品质的重要因素及乳脂代谢通路的研究进展 |
| 2.1 甘油三酯的在乳品质评价中意义 |
| 2.2 哺乳动物乳腺中的甘油三酯合成 |
| 2.3 乳脂代谢相关基因的简介 |
| 2.4 多不饱和脂肪酸在乳脂中的调控作用 |
| 2.5 乳汁中的甘油三酯表达 |
| 2.6 结语 |
| 第三章 线粒体基因及线粒体能量代谢的研究进展 |
| 3.1 线粒体的主要功能 |
| 3.2 线粒体在生命活动中的重要意义 |
| 3.3 线粒体在细胞死亡过程中的作用 |
| 3.4 线粒体能量代谢 |
| 3.5 结语 |
| 第四章 基因编辑技术的研究进展 |
| 4.1 转基因技术概况 |
| 4.2 精原干细胞技术 |
| 4.3 原始生殖细胞技术 |
| 4.4 胚胎干细胞基因打靶技术 |
| 4.5 条件基因靶向技术 |
| 4.6 诱导多能干细胞技术 |
| 4.7 CRISPR-CAS9 技术 |
| 4.8 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系的建立及其对细胞内乳脂代谢的影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 实验用酶 |
| 1.1.4 其他药品及试剂 |
| 1.1.5 试剂的配置 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.2.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆及鉴定 |
| 1.2.3 GPAM基因敲除靶位点的设定以及sg RNA的设计 |
| 1.2.4 gRNA的体外筛选 |
| 1.2.5 GPAM基因g RNA表达载体的构建 |
| 1.2.6 细胞培养及传代 |
| 1.2.7 敲除载体的的转染 |
| 1.2.8 细胞内编辑效率验证 |
| 1.2.9 敲除细胞的筛选、培养及鉴定 |
| 1.2.10 实时荧光定量PCR和 Western Blot检测候选基因的表达 |
| 1.2.11 GPAM基因表达载体与干扰载体鉴定 |
| 1.2.12 细胞内甘油三酯和胆固醇含量检测 |
| 1.2.13 细胞内脂肪酸含量的测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.3.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆和鉴定 |
| 1.3.3 gRNA浓度的测定 |
| 1.3.4 gRNA的体外筛选结果 |
| 1.3.5 敲除载体的构建及细胞转染 |
| 1.3.6 细胞内敲除效率验证 |
| 1.3.7 阳性细胞测序验证 |
| 1.3.8 GPAM过表达和干扰载体鉴定与检测结果 |
| 1.3.9 牛GPAM基因敲除后细胞内m RNA和蛋白表达的检测 |
| 1.3.10 GPAM基因表达对细胞内甘油三酯含量的影响 |
| 1.3.11 GPAM基因表达对细胞内胆固醇含量的影响 |
| 1.3.12 GPAM基因表达对细胞内脂肪酸含量的影响 |
| 1.3.13 GPAM敲除对脂代谢相关基因的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 其他药品及试剂 |
| 2.1.4 试剂的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA提取及质量检测 |
| 2.2.2 文库建立及测序 |
| 2.2.3 原始数据质量控制 |
| 2.2.4 Mapping结果统计及基因结构分析 |
| 2.2.5 差异基因表达分析 |
| 2.2.6 差异基因GO富集和KEGG分析 |
| 2.2.7 差异基因表达水平验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细胞总RNA提取及检测 |
| 2.3.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序数据筛选及分析 |
| 2.3.3 差异表达基因分析 |
| 2.3.4 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3.5 差异基因蛋白互作预测分析 |
| 2.3.6 GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析 |
| 2.3.7 基因共表达网络关系预测分析 |
| 2.3.8 差异基因的表达水平验证 |
| 2.3.9 GPAM基因对甘油三酯合成相关基因的调控作用 |
| 2.3.10 GPAM基因对脂肪酸合成相关基因的调控作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛GPAM基因对乳腺上皮细胞线粒体能量代谢的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验样品 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 其他药品及试剂 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞线粒体的提取 |
| 3.2.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体呼吸的检测 |
| 3.2.3 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.2.4 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.2.5 敲除细胞对ATP 需求的影响 |
| 3.2.6 细胞线粒体数量的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 敲除细胞中线粒体呼吸的检测 |
| 3.3.2 敲除细胞中线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.3.3 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.3.4 GPAM基因敲除后细胞内线粒体数量的改变 |
| 3.3.5 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中三羧酸循环检测分析 |
| 3.3.6 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中氧化磷酸化检测分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于敲除小鼠模型验证GPAM基因对脂肪代谢的调控作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 其他药品及试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 分析软件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 GPAM基因敲除小鼠模型的制备 |
| 4.2.2 GPAM基因敲除小鼠的扩繁 |
| 4.2.3 GPAM基因敲除小鼠的鉴定 |
| 4.2.4 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.2.5 目的基因敲除小鼠相关生长性状的测定 |
| 4.2.6 组织形态学的检测 |
| 4.2.7 敲除小鼠血清学相关指标的检测 |
| 4.2.8 敲除小鼠组织中甘油三酯和胆固醇含量的检测 |
| 4.2.9 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的检测 |
| 4.2.10 敲除小鼠组织中脂肪酸成分及含量的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 敲除小鼠的阳性鉴定 |
| 4.3.2 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.3.3 目的基因敲除小鼠相关生长性状测定 |
| 4.3.4 目的基因敲除小鼠各组织形态学分析 |
| 4.3.5 敲除小鼠血清中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.6 敲除小鼠血清中胆固醇含量的测定 |
| 4.3.7 敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织甘油三酯和胆固醇含量的测定 |
| 4.3.8 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.9 敲除小鼠乳腺脂肪酸含量的测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表的文章及专利 |
| 致谢 |
（9）基于PCR array技术探究AMPK信号通路对蛋鸡原代肝细胞脂肪变性的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 蛋鸡脂肪肝出血综合征 |
| 1.1 蛋鸡脂肪肝出血综合征概述 |
| 1.2 蛋鸡脂肪肝出血综合征的病因及发病机制 |
| 1.3 蛋鸡脂肪肝出血综合征体内模型与体外模型构建 |
| 1.3.1 蛋鸡脂肪肝出血综合征体内模型 |
| 1.3.2 蛋鸡脂肪肝出血综合征体外模型 |
| 2 AMPK信号通路 |
| 2.0 AMPK概述 |
| 2.1 AMPK的结构与表达 |
| 2.2 AMPK的调节激活方式 |
| 2.3 AMPK的生理功能 |
| 2.3.1 AMPK与脂类代谢的调节 |
| 2.3.2 AMPK与碳水化合物调节 |
| 2.3.3 AMPK与氧化应激 |
| 2.3.4 AMPK与细胞增殖 |
| 2.3.5 AMPK与细胞凋亡 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 高产蛋鸡原代肝细胞的提取与培养 |
| 1.5.2 高产蛋鸡原代肝细胞FFA模型的构建 |
| 1.5.3 实时无标记分析系统对细胞增殖的检测 |
| 1.5.4 油红O染色对脂肪变性肝细胞进行鉴定 |
| 1.5.5 糖原染色(PAS)对脂肪变性肝细胞进行鉴定 |
| 1.5.6 细胞氧化水平的检测 |
| 1.5.7 细胞脂质含量的检测 |
| 1.5.8 测定上清液葡萄糖含量 |
| 1.5.9 AO/EB检测FFA对肝细胞的影响 |
| 1.5.10 细胞内活性氧水平的检测 |
| 1.5.11 细胞线粒体膜电位的检测 |
| 1.5.12 PCR Array检测AMPK信号通路相关基因m RNA表达 |
| 1.5.13 目的基因实时荧光定量PCR |
| 1.5.14 Western blot检测AMPK通路相关蛋白表达 |
| 1.5.15 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 高产蛋鸡原代肝细胞的培养 |
| 2.2 高产蛋鸡原代肝细胞脂肪变性模型建立 |
| 2.3 脂肪变性对肝细胞增殖的影响 |
| 2.4 脂肪变性对肝细胞油红O染色的影响 |
| 2.5 脂肪变性对肝细胞糖原染色(PAS)的影响 |
| 2.6 脂肪变性对肝细胞糖脂代谢相关指标的影响 |
| 2.7 脂肪变性对肝细胞抗氧化功能的影响 |
| 2.8 脂肪变性对肝细胞AO/EB染色的影响 |
| 2.9 脂肪变性对肝细胞内活性氧(ROS)水平的影响 |
| 2.10 脂肪变性对肝细胞线粒体膜电位(MMP)的影响 |
| 2.11 脂肪变性对肝细胞PCR array的影响 |
| 2.11.1 RNA完整性程度的检测 |
| 2.11.2 PCR产物特异性分析 |
| 2.11.3 PCR array结果分析 |
| 2.12 实时荧光定量RT-PCR法验证差异性基因表达 |
| 2.13 脂肪变性对肝细胞相关蛋白表达水平变化的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 构建蛋鸡原代肝细胞脂肪变性模型 |
| 3.2 蛋鸡肝细胞脂肪变性对AMPK及其信号通路的影响 |
| 3.3 FFA对蛋鸡肝细胞脂质代谢的影响 |
| 3.4 FFA对蛋鸡肝细胞碳水化合物代谢的影响 |
| 3.5 FFA对蛋鸡肝细胞氧化还原的影响 |
| 3.6 FFA对蛋鸡肝细胞周期的影响 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 心肌致密化不全的研究背景与意义 |
| 1.1.1 心肌致密化不全的研究背景 |
| 1.1.2 维甲酸在心肌发育中关键的生理病理机制 |
| 1.1.3 心肌致密化不全基础研究的意义 |
| 1.2 心肌致密化不全的国内外研究历史与现状 |
| 1.2.1 心肌致密化不全的发现和命名 |
| 1.2.2 心肌致密化不全的流行病学调查 |
| 1.2.3 心肌致密化不全的分类 |
| 1.2.4 心肌致密化不全的病因和发病机制 |
| 1.2.5 心肌致密化不全的病理解剖学 |
| 1.2.6 心肌致密化不全的病理生理学和临床表现 |
| 1.2.7 心肌致密化不全的临床诊断与鉴别诊断 |
| 1.2.7.1 心肌致密化不全的临床诊断 |
| 1.2.7.2 心肌致密化不全的鉴别诊断 |
| 1.2.8 心肌致密化不全的治疗 |
| 1.2.9 心肌致密化不全的疗效与预后 |
| 1.2.10 心肌致密化不全的动物模型研究现状 |
| 1.2.11 心肌致密化不全基础和临床研究存在的问题 |
| 1.2.12 心肌致密化不全的基础和临床研究展望 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.4 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 建立心肌致密化不全动物模型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验试剂和仪器 |
| 2.2.2 实验小鼠 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 心肌致密化不全小鼠模型给药前准备 |
| 2.3.2 心肌致密化不全小鼠模型药物干预 |
| 2.3.3 心肌致密化不全小鼠模型组织收集和组织病理学染色 |
| 2.3.4 幼鼠心脏组织诊断标准与显微镜下观察 |
| 2.3.5 心肌致密化不全小鼠模型实验数据统计学分析 |
| 2.4 心肌致密化不全小鼠模型实验结果与分析 |
| 2.4.1 小鼠合笼后交配情况统计与分析 |
| 2.4.2 小鼠合笼后交配后怀孕情况统计与分析 |
| 2.4.3 RA干预组与对照组孕鼠生产情况统计与分析 |
| 2.4.4 RA干预组与对照组出生幼鼠体重统计与分析 |
| 2.4.5 RA干预组与对照组母鼠体重统计与分析 |
| 2.4.6 心肌致密化不全心脏病理学结果与分析 |
| 2.5 心肌致密化不全小鼠模型建立技术路线 |
| 2.6 本章讨论和结论 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 TMT相对定量蛋白质组学检测心肌致密化不全相关蛋白 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 实验小鼠 |
| 3.2.3 心肌致密化不全小鼠模型药物干预前准备 |
| 3.2.4 心肌致密化不全小鼠模型药物干预 |
| 3.2.5 心肌致密化不全小鼠模型心脏组织样品收集 |
| 3.2.5.1 RA干预组与对照组孕鼠及剖腹后幼鼠情况统计与分析 |
| 3.2.5.2 RA干预组与对照组幼鼠心脏组织样品收集与保存 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 蛋白质提取和肽段酶解 |
| 3.3.2 小鼠心脏组织样品TMT标记 |
| 3.3.2.1 样品蛋白组TMT分析预实验 |
| 3.3.2.2 蛋白组TMT分析正式实验 |
| 3.3.3 肽段分级 |
| 3.3.4 液相色谱串联质谱法数据采集 |
| 3.3.5 蛋白质鉴定和定量分析 |
| 3.3.6 生物信息学分析 |
| 3.3.6.1 GO功能注释 |
| 3.3.6.2 KEGG通路注释 |
| 3.3.6.3 GO注释和KEGG注释的富集分析 |
| 3.3.6.4 蛋白质聚类分析 |
| 3.3.6.5 蛋白质相互作用网络分析 |
| 3.4 TMT定量蛋白质组学检测心肌致密化不全相关蛋白结果分析 |
| 3.4.1 主要结果和结论 |
| 3.4.2 实验和生物信息学分析结果 |
| 3.4.2.1 蛋白质鉴定结果汇总 |
| 3.4.2.2 差异表达蛋白质筛选 |
| 3.4.2.3 差异表达蛋白质聚类分析 |
| 3.4.2.4 差异表达蛋白质GO功能富集分析 |
| 3.4.2.5 差异表达蛋白质KEGG通路富集分析 |
| 3.4.2.6 蛋白质相互作用网络分析 |
| 3.5 附件 |
| 3.5.1 质量控制 |
| 3.5.1.1 肽段离子质量偏差分布 |
| 3.5.1.2 肽段离子得分分布 |
| 3.5.1.3 蛋白质丰度比分布 |
| 3.5.2 鉴定蛋白质和肽段特性 |
| 3.5.2.1 蛋白质相对分子质量分布 |
| 3.5.2.2 蛋白质等电点分布 |
| 3.5.2.3 肽段序列长度分布 |
| 3.5.2.4 肽段序列覆盖度 |
| 3.5.2.5 鉴定肽段数量分布 |
| 3.5.3 数据库介绍 |
| 3.5.3.1 NR数据库 |
| 3.5.3.2 UniProt数据库 |
| 3.5.3.3 GO数据库 |
| 3.5.3.4 KEGG通路数据库 |
| 3.5.3.5 STRING数据库 |
| 3.6 TMT相对定量蛋白质组学检测NVM心脏组织技术路线 |
| 3.7 实验结果和讨论 |
| 3.7.1 能量代谢讨论 |
| 3.7.2 凝血功能讨论 |
| 3.8 本章小结 |
| 第四章 PRM技术验证和定量分析心肌致密化不全差异蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 项目样品基本信息 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 蛋白提取 |
| 4.3.2 蛋白酶解 |
| 4.3.3 液相色谱平行反应监测质谱定量分析 |
| 4.3.3.1 高效液相色谱分析 |
| 4.3.3.2 高分辨平行反应监测质谱定量分析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 目标肽段PRM检测结果分析 |
| 4.4.2 差异蛋白表达量分析 |
| 4.4.3 实验结果与结论 |
| 4.5 差异蛋白结构及功能的讨论及分析 |
| 4.5.1 激肽原1结构与功能 |
| 4.5.2 α1抗胰蛋白酶结构与功能 |
| 4.5.3 载脂蛋白AI结构与功能 |
| 4.5.4 β2糖蛋白1结构与功能 |
| 4.5.5 微管蛋白β4α链结构与功能 |
| 4.5.6 通道蛋白4结构与功能 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 后续工作展望 |
| 5.2.1 针对本实验不足的补充研究 |
| 5.2.2 针对本研究后续的工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
四、LYSOPHOSPHATIDIC ACID ACTIVATES NUCLEAR NUCLEOSIDE TRIPHOSPHATASE IN RAT HEPATOCYTES（论文参考文献）
- [1]5-甲氧基色氨酸经FOXO3a/miR-21/ATG5信号通路调控自噬抗肝纤维化作用及机制[D]. 童明. 湖南师范大学, 2021
- [2]环丙烯类脂肪酸对蛋鸡肝脏脂质代谢和蛋品质的影响及机制研究[D]. 杨傲. 华中农业大学, 2021(02)
- [3]P2X7受体在镉致小鼠骨质疏松中的作用[D]. 马勇刚. 扬州大学, 2021
- [4]基于UPLC-MS/MS的股骨头坏死骨组织外泌体代谢组学分析[D]. 郭民康. 重庆医科大学, 2021(01)
- [5]基于多组学策略研究蟾酥中活性成分对肝癌的治疗作用及其机制[D]. 张静慧. 浙江大学, 2021(01)
- [6]基于肥大细胞调控肥胖和能量代谢的机制研究白杨素干预高脂饮食相关代谢性疾病的作用[D]. 王新. 合肥工业大学, 2021(02)
- [7]下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展[D]. 张慧. 华南理工大学, 2020(05)
- [8]线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响[D]. 于海滨. 吉林大学, 2020
- [9]基于PCR array技术探究AMPK信号通路对蛋鸡原代肝细胞脂肪变性的调控作用[D]. 黄橙. 江西农业大学, 2020
- [10]维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究[D]. 曹菲. 电子科技大学, 2019(04)