一、可溶性HLA-A2-肽组装复合物的研制及初步鉴定（论文文献综述）
郭彩芬[1]（2021）在《大蹼铃蟾皮肤分泌物来源的多肽对LPS的中和活性及对MAPK/NF-κB信号通路影响的研究》文中进行了进一步梳理脓毒血症的是继发于感染的危及生命的急性器官功能障碍疾病,是全球需要共同面对的公共卫生问题。脓毒血症是治疗最昂贵的疾病之一,尽管临床医生的认识不断提高,诊断方法日趋完善,治疗措施也不断更新,但脓毒血症的发生率在不断增加,死亡率仍然很高。抗生素耐药和多重耐药的发生率不断增加,使得脓毒血症的治疗成为一个难题。此外,大多数抗生素对细菌释放的LPS没有影响,有时,在使用抗生素后细菌的裂解会释放更多的LPS,这反过来加重了患者的临床症状并增加了死亡率。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的主要成分,其结构由最保守的脂质A,核心多糖链和称为“O-抗原”的可变多糖链组成。天然免疫系统对LPS的监测是革兰氏阴性细菌宿主监测的关键。细胞外空间的LPS是由质膜定位的TLR4-MD2复合物以及它们的辅助受体CD14共同感知的,CD14能特异性识别LPS的脂质A结构。由适配器MyD88和TRIF介导的TLR4信号转导激活NF-κB和IRF3介导的炎性分子（包括细胞因子和趋化因子）的转录。LPS对TLR4的过度激活和随之而来的细胞因子风暴被认为是导致脓毒血症以及脓毒性休克的主要原因。抗微生物肽（antimicrobial peptides,AMPs）由地球上绝大多数生物体产生。已知的AMPs具有针对细菌、真菌、寄生虫、病毒以及微生物生物膜的多种生物活性。一些AMPs通过杀死病原体,结合或中和LPS并调节对感染的免疫反应来参与机体的防御过程。AMPs由于其潜在的生物学活性和免疫调节特性,已成为脓毒血症的替代疗法。LPS的中和或消除仍然是治疗脓毒血症的最有前景的方法。多粘菌素B是第一个通过与LPS结合而减少IL-1分泌和致死率的肽,但肾毒性限制了多粘菌素B的进一步应用,因此低毒性和较强生物活性的AMPs仍然是脓毒血症的潜在候选分子。但使用天然存在的AMPs作为治疗药物仍需克服一些困难。如在体内缺乏稳定性,对宿主细胞的潜在毒性等。本研究是从大蹼铃蟾的皮肤分泌物中分离纯化出具有LPS中和活性的多肽峰,并通过多肽组学测出多肽序列,使用分子对接技术筛选出与LPS结合能力较强的7个多肽,再通过生物膜层干涉技术筛选出两条与LPS结合能力最强的多肽,命名为肽2、肽7。肽2是一条由34个氨基酸残基构成的多肽,序列为DLLGQAGCTLVIGEEAGKEIADLTNSVIEDVLRK,肽 7 是一条由 15 个氨基酸残基构成的多肽,序列为NQPFTFTLGTGQVIK;肽2、肽7对临床常见的细菌没有直接的抑菌活性,但与LPS具有很强的结合能力,亲和力常数分别为1.05 ×10-9M,8.156 × 10-9M;肽2、肽7可显着抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞中促炎细胞因子的转录和分泌,包括TNF-α、IL-1β和IL-6;肽2、肽7阻断了丝裂原活化蛋白激酶（ERK、JNK和p38）和NF-κB信号通路的激活,在LPS刺激的RAW264.7细胞中发挥抗炎作用;体内实验表明肽2、肽7可降低LPS处理过的小鼠的死亡率,对脓毒血症小鼠具有保护作用;肽2、肽7与LPS的相互作用表明,肽2、肽7可以剂量依赖的方式部分中和LPS;肽2、肽7可阻断LPS与LPS结合蛋白的结合,从而抑制LPS诱导的细胞因子和其他炎症介质的释放;肽2、肽7具有免疫调节作用,包括部分中和LPS和抑制炎性细胞因子的产生。
顾霜霖[2]（2020）在《使用结构生物信息学方法研究HBV突变在肝癌免疫逃逸中的作用》文中研究说明HBV（Hepatitis B virus）感染是威胁我国乃至全球人民健康的一个重要问题,长期处于宿主肝细胞和免疫细胞的选择压力下,HBV病毒可能发生自发突变,改变病毒产生的抗原肽与MHC I（major histocompatibility complex class I）类分子的结合力,降低MHC I类分子对抗原肽的递呈,从而导致免疫逃逸。不同种族人群可能易感不同基因型的HBV病毒株,故本课题在大数据的背景下,选择中国人群高频出现的HLA-A*11:01（human lymphocyte antigen）亚型和欧美人群中高频出现的HLA-A*02:01亚型,同时收集亚洲人群和欧美人群易感的HBV亚型及其编码主要抗原的C和S编码区序列。在欧美人群易感的A亚型中,在C编码区收集到1086条病毒序列,S编码区收集到1390条病毒序列,而亚洲人群易感的B、C亚型中在C编码区分别收集到1573和2115条序列,S编码区分别收集到2581和2639条病毒序列。再通过对HBV病毒序列进行对比,保守性,理化性质,预测抗原肽打分等生物信息学手段分析,筛选到21个候选关键突变。接着基于关键突变,通过分子对接构建其产生的预测抗原肽与MHC I类分子的复合体结构,再对肽-MHC复合体使用氨基酸扫描分析筛选出11个会对抗原肽与MHC分子之间亲和力造成影响的突变,分别为:I155V,V149A,L149V,I156L,L213F,I256M,V351A,V354A,M372V,M372I,L389V。并使用分子动力学方法计算并比较复合体突变前后整体结合自由能产生的变化,计算结果显示这11个突变都会导致结合自由能不同程度的下降,其中L149V的突变对结合自由能的影响最大,由原本的136.52kcal/mol将至68.10kcal/mol,下降幅度高达50%,表明该位点的突变使其相应的抗原肽和MHC之间的结合力减弱。本研究发现了在中国和欧美人群高频出现的HLA-A*11:01和HLA-A*02:01亚型中,HBV病毒在C和S编码区的关键突变将会影响对其产生的突变抗原肽与相应MHC之间的亲和力,故推测候选的关键突变基因将会导致机体的免疫逃逸,可能与HBV感染相关的肝癌发生有关。
赵晨[3]（2019）在《HLA-A分子限制性HBV抗原表位肽的预测与鉴定及个性化ELISPOT检测方法的建立》文中研究指明研究背景:乙型肝炎病毒（HBV）感染是我国严重的公共卫生问题,它可以从急性感染发展到慢性肝炎、肝硬化、甚至肝细胞癌。抗病毒治疗是慢性乙肝的最根本疗法,核苷酸类似物（NAs）是当前的最主要药物,但只能抑制HBV复制,无法彻底清除HBV,导致慢性乙肝患者停药后经常复发。HBV感染诱发肝炎的主要病理机制是机体免疫反应所致。机体不同强度的免疫应答与HBV的清除、肝炎的发生以及疾病预后等密切相关,其中HBV抗原特异性CD8+T细胞介导的细胞免疫应答反应尤为重要。该免疫应答由病毒感染细胞的HLA-A、B、C等HLA I类分子提呈HBV抗原肽给特异性CD8+T细胞而启动和控制。由于HLA I类分子的等位基因在人群呈高度多态性,不同HLA I类分子提呈的抗原肽也各不相同,因此不同患者所引起的HBV特异性T细胞免疫反应强度各不相同。明确各种不同HLA I类分子限制性的HBV抗原表位肽是分析患者个性化HBV特异性细胞免疫功能状态的关键,有利于监测HBV患者在疾病进程中尤其是停药复发前后外周血中HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量及反应活性,有利于NAs联合免疫治疗的方案制定和疗效观察等。研究目的:鉴定基因总频率大于50%的3种HLA-A（HLA-A0201、A1101、A2402）分子限制的HBV抗原T细胞表位肽,用于建立检测HBV患者外周血中HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量及反应活性的酶联免疫斑点分析（Enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT）方法,制备一种新型的、个性化HBV抗原特异性细胞毒性T细胞（CTL）ELISPOT试剂盒,为乙型肝炎的疾病诊断、治疗方案制定、临床疗效评估以及慢性转归预测等提供全新的实验室指标,促进精准医疗的施行。研究方法:（1）针对HBV四种蛋白（HBs Ag、HBc Ag、HBpol、HBx）,通过六种表位肽预测网站（SYFPEITHI、BIMAS、SVMHV、IEDB、EPIJEN、NETMHC）预测筛选基因频率大于1%的13种HLA-A（HLA-A0101、A0201、A0203、A0206、A0207、A0301、A1101、A1102、A2402、A2601、A3001、A3101、A3303）分子限制性HBV抗原优势表位肽;（2）从东南大学附属南京市第二医院检验科收集慢乙肝住院患者外周血,分离外周血单个核细胞（PBMC）,将3种HLA-A分子的预测肽分为三组（HLA-A0201:9种、A1101:8种、A2402:8种）,分别刺激培养40h后,通过IFN-γELISPOT方法筛选出对任何一组混合肽有特异性CTL反应的乙肝患者;（3）重新采集CTL阳性反应的慢乙肝患者新鲜外周血,用相同的方法鉴定每组混合肽中单种抗原肽的免疫原性;并且通过聚合酶链反应-直接测序分型技术（PCR-SBT）对慢乙肝患者进行高分辨率HLA-A等位基因分型;（4）组装成基于这三种HLA-A分子的HBV特异性ELISPOT检测试剂盒:利用健康人外周血进行初步试验,同时与其他两大公司的基础试剂盒对比;将HLA-A0201、A1101和A2402分子限制的HBV抗原表位肽混合为3组,根据乙肝患者HLA-A等位基因的不同和其所限制性的HBV抗原肽,检测其外周血中HBV抗原特异性CD8+T细胞数量及反应活性,个性化分析患者针对HBV的特异性细胞免疫功能状态。研究结果:（1）通过六种表位肽数据库的虚拟预测,根据每种预测方法的评分标准筛选出每种HLA-A分子限制的候选HBV抗原T细胞表位肽,每种HLA-A分子再从中筛选出虚拟亲和力最高的针对4种HBV蛋白的8-9种表位肽作为待鉴定表位肽;（2）通过IFN-γELISPOT方法从126例慢乙肝患者中筛选出14例对HBV混合肽呈CTL阳性反应的患者,再对单种待鉴定肽的免疫原性进行鉴定。结果获得21种具有免疫原性的抗原肽,其中11种未见报道。13种被HLA-A0201限制和提呈,16种被HLA-A1101限制和提呈,11种被HLA-A2402限制和提呈。（3）成功组装了HBV抗原特异性CTL ELISPOT试剂盒,对50例慢乙肝患者进行了检测,其中14例呈明显CTL阳性反应,36例对上述21种抗原肽无CTL反应。结论:明确21种被3种HLA-A分子限制的HBV抗原肽,成功组装具有个性化特点的HBV特异性CTL ELISPOT检测试剂盒。
李申奥[4]（2019）在《胶质瘤相关抗原MAGE-D4 T细胞抗原肽的预测和鉴定》文中认为目的:预测胶质瘤相关抗原MAGE-D4的HLA-A2限制性T细胞抗原肽,分析这些抗原肽负载DC后是否能诱导出具有肿瘤杀伤作用的T细胞,为MAGE-D4的胶质瘤免疫治疗提供实验依据。方法:（1）MAGE-D4表位肽的预测:利用SYFPEITHI和BIMAS网站,分析HLA-A*0201限制性MAGE-D4 T细胞抗原肽,筛选高得分的候选肽;（2）肽-HLA-A2亲和力检测:合成筛选出的抗原肽,将抗原肽与T2细胞孵育,流式细胞仪检测HLA-A2表达荧光强度,分析抗原肽肽与HLA-A2的亲和力;（3）HLA-A*0201表型的筛选鉴定:提取胶质瘤细胞U87的DNA,用HLA-A*0201特性引物进行PCR鉴定;分离健康志愿者外周血单个核细胞（PBMC）,用流式细胞仪筛选HLA-A2健康志愿者。（4）树突状细胞（DC）的体外诱导培养及鉴定:分离HLA-A*0201健康志愿者的外周血PBMC,使用磁珠分选法从PBMC中分离出CD14+细胞,将用细胞因子（rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-a）与CD14+细胞孵育,诱导出成熟的DC,并通过形态学观察、细胞表面标志物（CD83,CD80,CD1a和HLA-DR）的流式细胞术检测对DC进行鉴定。（5）MAGE-D4抗原肽负载DC的制备:将细胞因子诱导培养至第3和第5天的DC用MAGE-D4抗原肽刺激,继续培养至第8天,收集MAGE-D4抗原肽负载DC;（6）效应T细胞的制备:T细胞磁珠分选试剂盒分离HLA-A*0201健康志愿者PBMC中的T细胞,将T细胞与MAGE-D4表位肽负载的DC（T细胞:DC为10:1）孵育,培养至第4天,再以同样的比例与MAGE-D4抗原肽负载的DC孵育,并加入IL-2继续培养4天,然后分别CCK-8和ELISPOT检测T细胞的增殖和分泌INF-γT细胞的频数。（7）效应T细胞杀伤实验:以10:1、20:1的效应细胞:靶细胞孵育,乳酸脱氢酶（LDH）释放法测定效应T细胞对U87细胞的杀伤作用。结果:（1）通过网站预测出HLA-A*0201限制性候选肽,序列如下:P1（SLLLVILGV）,P2（LLQERANK）,P3（CLPPPNVIL）,P4（ILSNEPWEL）和P5（RLSLLLVIL）;（2）流式细胞仪检测结果显示,除P1外,其余4个肽均与HLA-A*0201分子具有较好的亲和力（FI大于1）。（3）通过PCR检测确定U87细胞为HLA-A*0201表型,通过流式细胞仪筛选出HLA-A2健康志愿者。（4）CD14+细胞经细胞因子诱导后,呈现出典型的DC形态,并高表达CD1a,CD83,CD80和HLA-DR分子。（5）MAGE-D4抗原肽负载DC孵育T细胞后,CCK-8检测结果显示T细胞增殖,但各组间无统计学差异。IFN-γELISPOT检测结果显示分泌IFN-γ的T细胞显着增加,与对照组比较具有统计学差异（P<0.05）。（6）LDH检测结果显示,当效靶比为20:1时,负载P2-DC+TC组、P3-DC+TC组、P4-DC+TC组和P5-DC+TC组的效应性T细胞对U87细胞杀伤效率均明显高于未负载多肽的DC+TC组（P<0.05）;其中P3-DC+TC组、4-DC+TC组和P5-DC+TC组的杀伤效果随效靶比的增大而增强（P<0.05）。结论:MAGE-D4抗原肽（LLQERANK,CLPPPNVIL,ILSNEPWEL,RLSLLLVIL）致敏的DC可在体外诱导出具有杀伤肿瘤细胞的T细胞,提示这些MAGE-D4抗原肽具有用于胶质瘤免疫治疗的潜力。
王国强[5]（2018）在《O型口蹄疫病病毒多表位免疫原和表位嵌合病毒样颗粒研制及其免疫原性评价》文中认为口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一种感染偶蹄类动物的急性、烈性、传染性病毒疾病,感染包括牛,猪,羊家畜和其它许多野生动物物种。如果一个正常无口蹄疫的国家暴发和流行口蹄疫,感染动物的生产力将严重下降,甚至被扑杀,同时由于疫区封锁和动物产品贸易的限制,将会个该国家带来巨大的经济损失和负面的政治影响。目前防止口蹄疫传播的控制措施主要包括限制动物的活动,屠宰患病动物和与患病动物密切接触病的动物,以及在一些流行地区定期对动物进行大规模疫苗接种。对发达国家来说,上述三个措施基本都可以做到,但对那些经济实力差、技术落后的发展中国家,完全扑杀感染动物和密切接触动物是不现实的,疫苗免疫仍然是这些国家控制和预防口蹄疫发生的主要手段。我国根据实际国情,目前实行积极预防,国家强制免疫为主,一旦发现口蹄疫,立即采取扑杀相结合的综合防控策略。灭活疫苗是当前我国和世界上使用最广泛的疫苗,在控制和净化口蹄疫方面发挥了重大作用。但是,灭活疫苗在实际生产和使用过程中有很多限制性因素。例如,在培养口蹄疫病毒时,病毒逃逸生产现场和灭活不彻底等安全风险;疫苗可能含痕量的口蹄疫病毒非结构蛋白,造成无法区别动物免疫和病毒感染;灭活疫苗热稳定性差,在运输和贮藏整个过程需要低温;灭活疫苗可以预防口蹄疫发生,但是一旦爆发,不能从感染动物中清除体内存在的病毒。为解决灭活疫苗的这些缺点,目前许多努力致力于开发新型疫苗,安全高效的表位疫苗就成了候选疫苗之一。本研究选择O型口蹄疫结构蛋白VP1上两个B细胞表位和一个T细胞表位以及非结构蛋白3A上的一个T细胞表位作为靶序列表位,在其中一个B细胞表位中引入一个氨基酸突变,然后将4个表位进行不同顺序排列组合和表位的串联重复。通过人工合成3条核苷酸序列,构建重组质粒,在大肠杆菌中表达目的蛋白,重组蛋白经过纯化、复性和环化,免疫动物。其中重组多表位蛋白r P2在豚鼠体内刺激产生了略高于商业合成肽疫苗的特异性抗体水平,在体外,并诱导了强的细胞免疫反应。重组多表位蛋白r P2和佐剂ISA 50V2乳化后免疫猪,也刺激猪产生了和商品化疫苗无差异的抗体水平。在宿主动物猪上做攻毒保护试验时,重组蛋白r P2免疫猪中仅有部分猪（2/5）抵抗了FMDV的攻击。同时,以噬菌体MS2作为展示外源多肽的病毒样颗粒平台,构建并表达了嵌合FMDV表位的重组蛋白,该嵌合蛋白可以在体外自组装成病毒样颗粒,纯化后免疫动物,嵌合VLPs诱导动物产生了高于合成肽疫苗的特异性抗体滴度,也刺激产生了高于串联重复蛋白的细胞免疫反应。1、猪O型口蹄疫重组串联多表位抗原制备及免疫原性分析根据国内流行的猪O型口蹄疫SEA拓扑型Mya98谱系O/MYA98/BY/2010毒株序列,选择FMDV VP1上第124-167位（包含G-H环及其两翼序列）,第200-213位作为B细胞表位,VP1上第21-40位和非结构蛋白3A上第21-35位作为T细胞表位,在第124-167位上第158氨基酸引入突变（P158C）。将4个表位序列不同组合和串联重复,密码子优化后,人工合成3条序列。构建重组原核表达载体,转入大肠杆菌中诱导表达,三个蛋白均以包涵体形式表达。三个蛋白经过纯化,复性和环化,Western和间接ELISA检测,得到了有免疫活性的重组蛋白。三个重组蛋白和商业合成肽疫苗免疫豚鼠,经过环化和两个串联重复的多表位蛋白r P2刺激豚鼠产生了和合成肽疫苗无显着性差异的特异性抗体,并诱导产生了高于重组蛋白r P1和r P3的淋巴细胞增殖和细胞因子浓度（IL-2和IFN-γ）。从4种不同种类的佐剂中,选择佐剂ISA 50V2和重组多表位蛋白r P2组合是最优配伍。佐剂ISA 50V2和r P2乳化后免疫猪,刺激产生了和合成肽疫苗相当的特异性抗体水平。在攻毒保护试验中,免疫后第28天1000 ID50/2m L的O/Mya98/BY/2010开始攻毒,观察10天,5头猪中仅有2头猪抵抗了病毒的攻击,3头猪发病,其中2头猪延缓了发病时间,分别在第8天和第10天在一条腿蹄趾处出现水泡。重组多表位蛋白虽产生了部分保护,但还没有达到预期目的,需进一步分析原因,以待解决。2、噬菌体MS2介导的展示猪O型口蹄疫G-H Loop病毒样颗粒构建及免疫原性分析本试验以噬菌体MS2作为展示外源表位的载体平台,通过RT-PCR和SOE-PCR将FMDV VP1上第131-160位氨基酸基因序列插入噬菌体MS2外壳蛋白A-B环第15-16位氨基酸中间。构建重组质粒,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,嵌合蛋白经过PEG8000的初步纯化和凝胶过滤的进一步纯化,得到纯度达90%的目的蛋白,经过DLS和TEM物理表征,证实30个氨基酸的插入没有影响MS2外壳蛋白的组装,嵌合蛋白在体外自组装形成了嵌合病毒样颗粒。DOT-ELISA进一步表明口蹄疫表位被很好的展示在MS2病毒样颗粒表面。嵌合病毒样颗粒r P-CP-EP131-160和串联多表位蛋白r P–（EP131-160）3免疫小鼠,和串联多表位蛋白相比,嵌合病毒样颗粒诱导产生了更高的特异性抗体水平和更强的T细胞反应。在豚鼠免疫试验中,得到了类似的结果。在宿主猪体内是否也可以产生和合成肽疫苗同样的抗体水平,以及能否在猪免疫攻毒保护试验中提供完全保护,最终保护效果需要进一步动物试验来确认。
梁瑞英[6]（2018）在《家猫pFLA Ⅰ-167W/S和CD8αα精细结构与递呈抗原表位结构机理的研究》文中进行了进一步梳理主要组织相容性复合体I（Major Histocompatibility Complex,MHCI）表达在有核细胞表面,递呈内源性抗原至CD8+T淋巴细胞,使其识别并清除病毒感染的细胞或癌细胞。近三十年来人和鼠MHC I类分子抗原加工和递呈的相关研究颇为广泛。但有关猫MHC I（Feline Leucocyte Antigen,FLA I）分子多态性的研究报道较少,尤其是在结构生物学领域的研究。猫免疫缺陷病毒（Feline immunodeficiency virus,FIV）是引起猫获得性免疫缺陷综合征的重要病原体,与人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）同属于慢病毒属并具有相似的感染过程。因此,FIV/猫成为研究HIV感染的最小天然模型。MHC I分子能够呈递病毒多肽供细胞毒性T细胞识别,对于清除HIV等病毒的感染具有关键作用。但FLAI分子的结构和和功能并不清晰,则限制了对于抗FIV感染的深入研究。首先,本文通过PCR技术从12只家猫的外周血淋巴细胞中克隆了24条FLA I的E等位基因序列,进行多态性分析。将组成MHCI多肽结合槽（Peptide Binding Groove,PBG）的高变异位点定位到FLAI的三维结构上进行分析发现:构成PBG的高变异位点主要位于B口袋和D口袋,能影响FLAI递呈表位多肽的特性。其次,本研究为明确家猫FLAI递呈FIV的结合基序,通过生物信息学预测与等位基因FLA-E*01801结合的表位肽,筛选得到一条能够体外结合FLA-E*01801的FIV九肽（gag:40-48;RMANVSTGR）;通过体外复性、X-ray衍射进一步解析了FLA-E*01801复合体结构。Glu63和Trp167通过氢键和范德华力与多肽Pl-Arg相互作用,其是组成FLA-E*01801 A 口袋的重要氨基酸,不同物种MHC I在该位置的氨基酸并不保守。突变实验表明Glu63和Trp167是导致FLA-E*01801限制性的关键氨基酸位点,本研究利用的所有肽均不能辅助突变体FLA-E*01801-63E/N形成稳定复合物,而能够辅助FLA-E*01801-167W/S形成稳定复合物,复性效率升高且解除P1-Asp的限制性。FLA-E*01801.167W/S递呈RMA9-P1D的结构表明Trp167的大侧链导致FLA-E*01801A 口袋N端封闭,同时P1-Asp受到Glu63的排斥,而突变的Ser167导致N端开放,解除P1-Asp的限制。因此,FLA-E*01801复合物A口袋可限制性结合P1-Asp,表明FLA-E*01801复合物A口袋具有限制性。通过生化实验鉴定了FLA-E*01801的九肽结合基序为X（exceptD）-M/T/A/V/IL/S-X-X-X-X-X-X-R/K,根据FLA-E*01801 的结合基序,鉴定了 125条FIV潜在9肽结合表位。此外,本研究通过解析猫CD8αα晶体结构（fCD8αα）发现,fCD8αα分子以二聚体形式存在,且CD8αα的CDR1区域刚性结构比较强,CDRlloop和CDR3 loop通过两个氢键相互作用,形成排列紧密的结构。本研究首次发现MHCIA口袋具有限制性,鉴定了FLA-E*01801的结合基序,为深入研究FIV和HIV多肽疫苗奠定基础。
邓阳,高顺平,吴国华,张强[7]（2017）在《MHC四聚体技术研究进展》文中提出主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）-四聚体（tetramer）技术是模拟生物体内抗原提呈原理,将4分子的生物素化的MHC-抗原肽单聚体与1分子荧光标记的链霉亲合素连接成四聚体复合物,定向、定量对抗原特异性T细胞进行分析及检测。该技术已被用于疾病诊断、疾病防控和相关科学研究,尤其在病毒、癌症、自身免疫疾病方面具有广阔的应用前景,是当今免疫学和分子生物学领域研究的热点之一。文章就MHC的分子结构基础,四聚体的制备、优化及其应用做一综述。
肖进[8]（2017）在《鸡MHCI分子呈递病毒多肽的晶体结构及功能研究》文中进行了进一步梳理细胞免疫应答是鸡免疫系统中的重要组成部分,其在抵御病原入侵、保护机体健康方面发挥着重要作用,其中CD8+T细胞介导的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTL）在抗病毒感染中扮演重要角色。CTL反应的激活是依赖主要组织相容性复合体（Major histocompatibility Complex,MHC）Ⅰ类分子将胞内降解加工的抗原多肽递呈给T细胞受体（Tcell receptor,TCR）。鸡的MHCI又称为BF2,鸡群中主要分布的等位基因包括BF2,*0201、BF2*0401、BF2*1501、BF2*2101、BF2a*1201等。然而,BF2*1201的结构与功能迄今尚未解析,其呈递病毒多肽的机理也尚未阐明。首先,本文运用大肠杆菌系统分别表达BF2*1201的胞外区、禽源β2m蛋白,将BF2*1201重链、轻链分别同致瘤（vSRC）源性及禽流感源性抗原多肽进行体外共复性,筛选到亲和力较强多肽A6（AVKGVGTMV）、P1、P2、A1以及vSRC（LPACVLEV）。根据以上数据,初步推断BF2*1201结合多肽的锚定基序为X（V/A/P/E）XX（V/I）XX（V/M）。进一步将BF2a*1201分子结合多肽的复合物进行纯化、结晶试验并最终得到BF2*1201-vSRCLV8-Chβ2m及BF2*1201-A6AV9-Chβ2m高质量的复合物晶体。然后,通过 X 光晶体衍射法解析了 BF2*1201-vSRCLV8-Chβ2m 及 BF2*1201-A6AV9-Chβ2m 复合物晶体结构,展示了 MHCI抗原结合槽的口袋氨基酸组成及抗原多肽与结合槽的作用力关系,发现BF2*1201分子中B、.C、F 口袋对结合抗原多肽较为重要。分析比较两条多肽的递呈构象,发现BF2*1201递呈九肽构象时P8位残基"代替"P9位残基,其侧链插入F 口袋中,P9位残基侧链构象伸出结合槽C端,BF2*1201分子的R83侧链向结合槽外侧摆动,形成"Open back door"式构象。这种MHCI类分子独特的结合槽C端开放式结构,在已解析的禽类MHCI类分子结构中尚属首次发现。在某种程度上,禽类MHCI可能存在对称式的多肽锚定基序（-X-----X-）,锚定残基为PN+1和PC-1。利用生物信息学方法对R83进行了相关分析,发现它在大多数低等脊椎动物包括爬行类、两栖类、鱼类、禽类的MHCⅠ类分子中均保守;在哺乳类动物中为保守的Y（Tyr）;在已知其他的MHC Ⅱ类分子中,对应位点也为较保守的R（Arg）。这种MHCⅠ与Ⅱ结合槽残基与多肽相互作用的保守性为证实MHCⅠ起源于MHCⅡ的假说提供了一定的证据。接着,我们将vSRCLV8和A6AV9多肽N端第2位、第5位及第8位残基分别进行了 Gly（G）的突变替代,将突变多肽分别同BF2*1201分子进行了标准化复性及蛋白的热稳定性实验,结果表明:多肽N端第2位、第5位以及第8位残基侧链变短后,多肽同目标分子结合能力下降明显,其中多肽N端第5位（P5）和第8位（P8）残基尤为重要,具有显性锚定特征。我们延长了 BF2*1201分子洗脱多肽的C端,通过复性结合实验证实了目标分子能够递呈结合C端延长突变多肽的推论。最后,结合解析的结构数据及相关文献报道,我们设计数组合适的鸡禽流感T细胞表位分别同禽流感灭活Re-6株抗原一同免疫SPF鸡群,监测免疫动物的抗体水平及相关细胞因子（IFN-γ及IL-4）表达水平变化。最终,我们发现多肽PS0804及PS0816对禽流感灭活抗原的抗体效价水平均有显着的提升作用,并且PS0804对细胞免疫应答亦有一定的促进作用。这部分工作尝试为禽流感多肽表位疫苗的研制打下了基础。综上所述,本研究首次解析了 BF2*1201分子的晶体结构,阐明了其递呈抗原多肽的机理,发现了禽类抗原结合槽的新特点及BF2*1201分子多肽锚定基序新特征;结合动物实验筛选得到有效的鸡禽流感T细胞表位,为T细胞表位在疫苗生产方面的应用总结了宝贵的经验,也为设计合适的新型禽用表位疫苗奠定理论基础。
许涛[9]（2017）在《磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞数量与功能的检测》文中进行了进一步梳理当今医学检验试剂领域,病原体特异性基因、抗原和抗体的检测试剂盒很多,竞争性也很强,但是却没有厂家生产针对病原体特异性T细胞的检测试剂盒。抗原特异性T细胞（Antigen-specific Tcell,AST）是介导适应性免疫应答的核心细胞,在清除与控制病原体感染、监视和杀伤肿瘤细胞及自身免疫性疾病的免疫损伤中发挥着至关重要的作用。众所周知,在抗病毒感染和抗肿瘤中,细胞免疫比体液免疫更加重要,即T细胞的作用比B细胞产生的抗体更重要。抗原特异性T细胞数量的多少和功能的强弱直接反映了人体特异性细胞免疫的功能状态,在监测疾病进程、指导治疗方案、评价临床疗效、预测疾病慢性转归以及疫苗效果评估等方面都有着不同于抗体的重要参考价值。尽管抗原特异性T细胞的检测技术从最初的51Cr释放法、有限稀释法、细胞内细胞因子染色法到现在的ELISPOT法、pMHC多聚体流式分析法、蛋白芯片法等已经有了快速发展。尽管这些技术方法各有优点,但是各自的缺点也非常明显。目前临床上依然极少对患者进行抗原特异性T细胞数量和功能的监测。因此,进一步探索操作简便、无需特殊仪器、无需HLA基因分型、能同步检测抗原特异性T细胞数量和功能的新方法和新试剂非常重要和急迫,为精准医疗提供重要的诊疗手段。研究目的:将磁珠式人工抗原提呈细胞技术、ELISPOT技术、磁性细胞分选技术以及微孔反应板有机整合一体,建立特异性细胞免疫功能状态的检测平台:即磁珠式人工抗原提呈细胞微孔反应板（aAPC-microplate）。首先,自制H-2Kb/OVA257-264单链三聚体（SCT）,利用aAPC-microplate同步检测OT-1转基因鼠中OVA257-264抗原特异性CD8+ T细胞的数量和功能,进行方法学评估;然后用同样技术制备HLA-A2/HBV peptide多聚体,利用aAPC-microplate技术对慢性乙肝患者和健康体检者的外周血中HBV特异性CD8+ T细胞的数量与功能进行同步检测,对该方法进行初步临床验证。研究方法:1)利用重叠延伸 PCR 技术将 OVA257-264、（GS4）3、β2m、（GS4）4和 H-2Kb （α1/α2/α3）依次串联为H-2Kb/OVA257-264单链三聚体基因（SCT）,联合同源重组克隆技术将其插入pET28a原核表达载体,制备pMHC单体和四聚体,验证其空间构象和与TCR的结合能力;然后包被磁珠,制备成人工抗原提呈细胞微孔反应板,同步检测OT-1转基因鼠中OVA257-264抗原表位特异性CD8+T细胞的频率和反应活性,进行特异性、准确性、灵敏度、重复性或精密度等方法学指标的评估,并与进口商品化H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体荧光流式检测法进行配对t检验和Pearson相关性分析,同时与传统ELISPOT法比较反应活性的检测;2)用金标准的PCR-Sequencing-Based Typing技术对86例健康体检人员血液样本和118例江苏地区汉族2型糖尿病血液标本分别进行HLA-A和HLA-B等位基因分型;利用基因重组克隆技术构建和表达所有频率大于1%的13种HLA-A等位基因重链重组质粒和8种常见HBV抗原表位与β2m轻链的重组质粒;利用6种在线表位预测数据库和软件对 HLA-A*01:01、A*03:01、A*30:01、A*31:01、A*32:01、A*33:03和A*6801等7种HLA-A等位基因分子限制性的HBV相关抗原表位肽进行预测;3)利用重叠延伸PCR和同源重组克隆技术构建和表达HLA-A*0201/HBc18-27、HLA-A*0201/HBs183-191、 HLA-A*0203/HBc18-27、 HLA-A *0203/HBs183-191、HLA-A*0206/HBc18-27等五种HLA-A2/HBVpeptide的单体和四聚体,包被磁珠,制备成制备成人工抗原提呈细胞微孔反应板;对临床慢性乙肝患者、健康体检者外周血中HBc18-27和HBs183-191抗原表位特异性CD8+ T细胞的数量与功能进行同步检测;并与进口商品HLA-A2-Ig二聚体的荧光流式分析法和传统ELISPOT法进行比较。研究结果:1)成功构建和表达H-2Kb/OVA257-264 SCT融合基因,制备成H-2Kb/OVA257-264 SCT单体,包被磁珠后用H-2Kb构象特异性荧光单抗染色和流式分析,证实能强烈结合,提示构象正确;制备成荧光标记的H-2Kb/OVA257-264 SCT四聚体,流式法检测4只OT-1鼠脾淋巴细胞群中OVA257-264抗原表位特异性CD8+T细胞频率。结果与进口商品化H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体的流式检测结果无统计学差异,证实H-2Kb/OVA257-264 SCT与TCR的结合能力;2) 7只OT-1鼠脾淋巴细胞群同时经aAPC-microplate法和H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体流式染色法检测OVA257-264表位特异性CD8+T细胞的频率,结果经配对t检验显示p=0.2464,表明无统计学差异,Pearson回归分析显示,相关系数r=0.946,P<0.01,相关方程为:Y=0.936X + 3.262,显示两种检测方法的吻合度很高;用H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体流式染色法检测aAPC-microplate孔内剩余细胞中OVA257-264特异性CD8+ T细胞的纯度,三次实验分别为92.35%、91.22%和92.10%,表明aAPC-microplate法的特异性达到90%以上;aAPC-microplate法检测7只OT-1鼠时,分析内 CV 值分别为 6.44%、4.01%、6.31%、9.08%、6.63%、4.24%和 3.11%,对其中1只进行三次独立重复检测,结果分别为25.47%、25.59%和24.49%,平均分析内CV值分别为3.11%、4.41%和10.62%,三次检测结果的分析间CV值为2.40%,平均分析内CV值均低于15%,表明该检测方法有良好的重复性或精密度,符合我国2000版生物制品鉴定标准;灵敏度分析显示,在5个不同稀释频率（10%, 1%,0.1%,0.05%,0.01%）的样品检测中 aAPC-microplate 法与 H-2Kb-Ig/OVA257-264 二聚体流式染色分析法的配对t检验无统计学差异,p=0.3973, Pearson分析的相关系数r=0.998,P<0.01,相关性方程为:Y=0.943X +0.21,aAPC-microplate方法可检测的频率下限低至0.01% - 0.05%,与传统的MHC多聚体染色加流式分析法相似,该灵敏度能满足临床标本检测的需要;3) 3只OT-1鼠脾淋巴细胞经aAPC-microplate检测频率后,分选后的OVA257-264特异性CD8+T细胞群经ConA刺激后分泌IFN-γ的反应活性比分别为43.83%、41.87%和48.99%;同时对3只OT-1鼠脾淋巴细胞用传统ELISPOT方法进行检测,在OVA257-264抗原肽刺激后脾淋巴细胞群中分泌IFN-γ的细胞比例经直线回归方程校正后分别为4.44%、4.01%和4.98%。由于原理和结果表现形式不同,两种方法的活性检测结果不能直接比较;4)在对人群血液标本进行HLA-A/B位点基因分型中,共获得所有频率大于1%的13种HLA-A等位基因型和32种HLA-B等位基因;成功构建和表达13种HLA-A等位基因的重链重组质粒和8种常见HBV抗原表位与β2m轻链的重组质粒;利用在线表位预测数据库预测获得 HLA-A*01:01、A*03:01、A*30:01、A*31:01、A*32:01、A*33:03和A*6801等7种等位基因型限制性的HBV抗原表位肽序列,每种等位基因均获得多个高亲和力的候选表位肽,分别来自HBsAg（P03138）、HBcAg（P03146）、HBpol（P03156）和HBx（P03165）等4种HBV抗原蛋白分子;5) 成功构建和表达HLA-A*0201/HBc18-27、HLA-A*0201/HBs183-191、HLA-A*0203/HBc18-27、HLA-A*0203/HBs183-191、HLA-A*0206/HBc18-27 等五种 HLA-A2/HBVpeptide的SCT分子,分别包被磁珠,制备成5种aAPC-beads,按照1:1的比例混合,制备成 HLA-A2 限制性、HBc18-27和 HBs183-191 表位特异性的 aAPC-microplate;6)用 aAPC-microplate 法和进口 HLA-A2-Ig/HBc18-27/HBs183-19 二聚体流式染色法对 10例HLA-A2阳性慢性乙肝患者、15例HLA-A2阴性慢性乙肝患者和15例HLA-A2阳性健康体检者的PBMC进行检测。配对t检验显示,两种方法对三组临床标本的检测结果均无统计学差异,p值分别为0.0821、0.0529和0.0594; Pearson相关性分析显示,相关系数r=0.980, P<0.01,相关性方程为:Y=0.984X-0.05,两者的吻合度很高;HLA-A2阳性慢乙肝患者外周血中HBc18-27和HBs183-191表位特异性的CD8+T细胞的频率明显高于两个对照组（0.1957% ± 0.0672% vs. 0.0176% ± 0.0068%,0.1957% ± 0.0672% vs. 0.0249% ± 0.0077%）;7) 10名HLA-A2阳性慢性乙肝患者的PBMC经aAPC-microplate法检测频率后,分选后的HBc18-27和HBs183-191表位特异性的CD8+T细胞群经PHA刺激后分泌IFN-γ的反应活性比为22.79%± 3.40%;而同时患者PBMC中整体T细胞群经PHA刺激后的反应活性比为36.35% ± 3.58%,明显高于HBc18-27和HBs183-191表位特异性的CD8+ T细胞群的反应活性。这些结果提示:慢性乙肝患者体内针对乙肝病毒的特异性CD8+T细胞尽管频率高于健康者人群,但是其针对HBV抗原刺激后的活化、增值和分化能力低下。这可能是导致患者感染HBV后慢性转化的重要原因。研究结论:利用自制MHC多聚体建立的aAPC-microplate技术能对OVA257-264抗原特异性CD8+T细胞的数量和功能进行同步检测,具有很好的准确性、特异性、灵敏度、重复性或精密度,可检测的比例下限低至0.01% - 0.05%;利用自制HLA-A2/HBc18-27/HBs183-191 SCT多聚体建立的aAPC-microplate技术能对慢性乙肝患者临床血液标本中的HBc18-27和HBs183-191抗原特异性CD8+ T细胞数量和功能进行同步检测,与传统的MHC多聚体流式染色法检测结果无显着性差异,两者吻合度极高。
樊淑华[10]（2016）在《猪MHCI晶体结构及结合IAV和PRRSV表位特性的研究》文中研究指明主要组织相容性复合体Ⅰ（Major Histocompatibility Complex,MHC I）编码的分子是参与抗原提呈,激活细胞毒性T细胞（Cytotoxic Lymphocyte,CTL）产生特异性免疫应答的关键分子。CTL细胞通过特异性识别抗原肽-MHC复合物（peptide-MHC complex,pMHC）而启动。不同MHC分子可选择性地结合具有不同锚定位和锚定残基的肽段,造成不同个体对同一抗原的应答在强度上出现差异。从不同种属和个体MHC分子群中筛选、鉴定出特定病原的优势pMHC分子,并进一步阐述其结构和功能机理及应用潜力是一项十分新颖的重要研究课题。本研究选择中国地方特色猪种藏香猪和黑山猪,采用PCR技术从藏香猪组织中克隆了 21条猪MHC Ⅰ（swine leukocyte antigen,SLAⅠ）基因,与实验室已克隆的28条黑山猪基因、44条长白猪基因以及IPD-MHC数据库中所有经典的SLA Ⅰ有效全长基因（86条）的胞外区一起构建了系统发育树,采用Wu-kabat法分析了三个猪种的高变异位点,并将组成多肽结合槽（peptide binding groove,PBG）的高变异位点定位到SLA Ⅰ三维结构（3D）上,证实了构成多肽结合槽的高变异位点能够影响SLA Ⅰ呈递多肽表位的特性。应用生物信息学方法预测了藏香猪、黑山猪和长白猪结合PRRSV和IAV多肽的能力,并通过体外复性实验筛选了能够结合更多表位多肽的优势SLA Ⅰ分子。采用蛋白结晶技术解析了黑山猪SLA-3*hs0202与流感病毒血凝素蛋白（HA-KMN9）复合物晶体结构。该结构在一个不对称晶胞内包含两个pSLA Ⅰ分子,且两分子中HA-KMN9多肽具有不同的构象。另外,与已解析的其他MHC晶体结构不同,同一晶胞中的两个分子RMSD值为0.873 A,远远高于同一晶胞中存在两个分子的猪SLA-1*0401（0.401 A）和牛BoLA-N*01801（0.267 A）。进一步分析发现,多肽构象的差异不仅与多肽结合槽（PBG）氨基酸的侧链有关,还与α1、α2主链的偏移有关。该结果表明,MHC分了碳主链的柔韧性也可能导致多肽构象的差异,从而更有利于多肽与TCR的结合。另外,本研究通过体外复性实验筛选了藏香猪SLA-1*0501分子结合的PRRSV表位肽,并通过蛋白结晶技术解析了藏香猪SLA-1*0501 与PRRSV-GP3ALL9多肽的晶体结构（pSLA-1*0501）。根据多肽P2位和Pc锚定残基预测了 SLA-1*0501结合PRRSV病毒株（VR-2332、JXwn06 毒株）表位多肽。构建了藏香猪 SLA-1*0501-BSP/ALL9、SLA-1*0501-BSP/RLY9 两条多肽的四聚体,并验证了 GP5-RLY9多肽的生物学活性。综上所述,本研究通过生物信息学方法和体外复性实验,筛选了藏香猪、黑山猪优势SLA Ⅰ分子。解析了黑山猪SLA-3*hs0202结合流感病毒表位复合物的晶体结构,阐明了SLA Ⅰ分子递呈流感抗原多肽的分子机制。解析了藏香猪SLA-1*0501结合PRRSV表位肽的晶体结构,并制备了藏香猪SLA-1*0501-BSP结合PRRSV多肽的四聚体。研究结果推进了猪分子免疫学的发展,为猪抗病育种及病毒表位疫苗的研发奠定了基础。
二、可溶性HLA-A2-肽组装复合物的研制及初步鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、可溶性HLA-A2-肽组装复合物的研制及初步鉴定（论文提纲范文）
（1）大蹼铃蟾皮肤分泌物来源的多肽对LPS的中和活性及对MAPK/NF-κB信号通路影响的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 脓毒血症 |
| 1.2 LPS |
| 1.3 抗微生物肽 |
| 第2章 抗内毒素肽的筛选 |
| 引言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第3章 抗内毒素肽的体外活性研究 |
| 引言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第4章 抗内毒素肽体内治疗效果的评价研究 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 研究创新与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 抗菌肽在人类疾病中的作用及其作为免疫治疗的潜力 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）使用结构生物信息学方法研究HBV突变在肝癌免疫逃逸中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 Hepatitis b virus病毒的特征 |
| 1.1.1 HBV病毒的基因结构 |
| 1.1.2 HBV病毒入侵机制 |
| 1.1.3 不同种族人群中HBV基因型的感染偏好 |
| 1.2 MHC分子的特征 |
| 1.2.1 MHC分子相关抗原肽的加工过程 |
| 1.2.2 经典的HLA复合体结构 |
| 1.2.3 MHC分子、抗原肽和TCR间的相互作用 |
| 1.2.4 HLA在临床医学应用及疾病中的研究进展 |
| 1.3 HBV病毒突变的研究进展 |
| 1.3.1 HBV病毒自发突变及HBV DNA插入宿主肝细胞基因组 |
| 1.3.2 HBV相关肝癌的用药及其耐药机制的相关研究 |
| 1.3.3 HBV的重激活 |
| 1.3.4 HBV相关的免疫逃逸 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 数据收集 |
| 2.1.1 HBV病毒基因组序列收集 |
| 2.1.2 HLA亚型及其结构的收集 |
| 2.2 HBV突变抗原肽的预测 |
| 2.2.1 不同基因型HBV参考序列的确定,保守性及理化性质的分析 |
| 2.2.2 HBV突变位点的确定及抗原肽预测 |
| 2.3 模拟HBV抗原肽与MHC I类分子的对接 |
| 2.3.1 蛋白质准备 |
| 2.3.2 分子对接 |
| 2.4 扫描氨基酸突变计算 |
| 2.5 分子动力学模拟 |
| 2.5.1 分子动力学模拟参数设置 |
| 2.5.2 RMSD分析 |
| 2.6 结合自由能计算 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 中国和欧美人群中HBV突变位点的特征 |
| 3.2 预测的21 个候选突变 |
| 3.3 HLA分子与抗原肽对接结构的特征 |
| 3.4 影响p-MHC复合体形成的13 个关键突变 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 主要科研成果 |
（3）HLA-A分子限制性HBV抗原表位肽的预测与鉴定及个性化ELISPOT检测方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写词 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HLA Ⅰ类分子限制的 HBV 抗原表位肽的验证及临床应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一章 利用PCR-SBT法检测慢乙肝患者HLA-A等位基因 |
| 引言 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 HLA-A分子限制性HBV抗原肽的虚拟预测与实验鉴定 |
| 引言 |
| 第一节 13种HLA-A分子限制性的HBV抗原肽的预测 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第二节 三种 HLA-A 分子限制性的 HBV 抗原肽的免疫原性鉴定 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三章 HBV抗原特异性CTL ELISPOT检测试剂盒的组装与应用 |
| 引言 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）胶质瘤相关抗原MAGE-D4 T细胞抗原肽的预测和鉴定（论文提纲范文）
| 英文缩略词索引 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 绪论 |
| 实验设计方案 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）O型口蹄疫病病毒多表位免疫原和表位嵌合病毒样颗粒研制及其免疫原性评价（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 文献综述 |
| 1.口蹄疫 |
| 1.1 口蹄疫概况 |
| 1.2 世界范围内口蹄疫流行情况 |
| 1.3 中国口蹄疫流行情况 |
| 1.4 口蹄疫防控 |
| 2.口蹄疫病毒的基本特性 |
| 2.1 生物学特性 |
| 2.2 病毒基因组组成及其功能 |
| 3.口蹄疫疫苗研究进展 |
| 3.1 弱毒疫苗 |
| 3.2 灭活疫苗 |
| 3.3 基因工程亚单位疫苗 |
| 3.4 表位疫苗 |
| 3.4.1 表位疫苗免疫学理论基础 |
| 3.4.2 抗原表位筛选与鉴定 |
| 3.4.3 表位疫苗的设计 |
| 3.4.4 表位之间的连接 |
| 3.4.5 口蹄疫表位疫苗 |
| 3.5 病毒样颗粒疫苗 |
| 3.6 活载体疫苗 |
| 3.7 核酸疫苗 |
| 3.8 总结 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 FMDV串联重组表位抗原的制备和免疫原性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 质粒、动物、灭活病毒、商业疫苗和佐剂 |
| 1.1.2 主要试剂和试剂盒 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 多表位基因的设计及合成 |
| 1.2.2 目的基因片段和粘性末端线性化载体的获得 |
| 1.2.3 重组质粒构建 |
| 1.2.4 重组质粒的筛选与鉴定 |
| 1.2.5 重组串联蛋白表达与纯化 |
| 1.2.6 重组串联重复表位蛋白的纯化和复性 |
| 1.2.7 串联重组多表位蛋白的环化 |
| 1.2.8 复性串联重组多表位蛋白免疫活性测定 |
| 1.2.9 重组串联重复表位蛋白在豚鼠内引起的免疫反应分析 |
| 1.2.10 佐剂的筛选 |
| 1.2.11 候选重组多表位蛋白在猪体内引起的抗体水平 |
| 1.2.12 猪攻毒保护试验 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 多表位串联重组表位蛋白构建策略 |
| 1.3.2 重组质粒构建 |
| 1.3.3 重组载体鉴定 |
| 1.3.4 重组蛋白表达 |
| 1.3.5 重组蛋白纯化和复性 |
| 1.3.6 .复性蛋白免疫活性检测 |
| 1.3.7 重组多表位蛋白引起豚鼠免疫反应分析 |
| 1.3.8 佐剂筛选 |
| 1.3.9 rP2引起猪产生抗FMDV特异性抗体检测 |
| 1.3.10 攻毒试验 |
| 2 讨论 |
| 3 小结 |
| 第二章 噬菌体MS2介导的口蹄疫主要抗原表位G-H环嵌合病毒样颗粒免疫原性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 质粒、灭活病毒、灭活疫苗和佐剂 |
| 1.1.2 主要试剂和试剂盒 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 重组质粒的构建 |
| 1.2.3 重组蛋白的表达及可溶性分析 |
| 1.2.4 重组蛋白的纯化 |
| 1.2.5 重组蛋白的物理表征 |
| 1.2.6 重组蛋白免疫活性检测 |
| 1.2.7 疫苗制备及小鼠免疫 |
| 1.2.8 嵌合病毒样颗粒和串联重复蛋白豚鼠免疫 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.3.1 RT‐PCR和 SOE‐PCR获得目的基因 |
| 1.3.2 重组质粒的鉴定 |
| 1.3.3 重组蛋白可溶性分析 |
| 1.3.4 重组蛋白纯化结果 |
| 1.3.5 重组蛋白免疫活性分析 |
| 1.3.6 病毒样颗粒物理表征 |
| 1.3.7 嵌合病毒样颗粒和串联多表位蛋白在小鼠体内免疫反应评价 |
| 1.3.8 嵌合病毒样颗粒和串联多表位蛋白在豚鼠体内免疫反应检测 |
| 2 讨论 |
| 3 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 附录部分 |
| 附录A 缩略词表 |
| 附录B 攻毒博士期间发表及待发表的学术论文 |
| Abstract |
（6）家猫pFLA Ⅰ-167W/S和CD8αα精细结构与递呈抗原表位结构机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 MHC Ⅰ类分子的研究进展 |
| 1.1.1 MHC分子的发现 |
| 1.1.2 MHC Ⅰ类分子的功能 |
| 1.1.3 病原和肿瘤逃逸MHC Ⅰ类分子递呈抗原策略 |
| 1.1.4 MHC Ⅰ类分子的结构 |
| 1.1.5 基于MHC技术检测抗原应答T细胞的研究进展 |
| 1.1.6 猫MHC Ⅰ类分子的研究进展 |
| 1.1.7 FIV的基因组结构和分子特征 |
| 1.1.8 CD8分子的结构 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 1.3 研究内容和技术路线 |
| 1.4 研究目标 |
| 第二章 FLA Ⅰ多态性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 猫 |
| 2.2.2 载体及菌株 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.2.5 常用溶液及试剂的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 引物设计 |
| 2.3.2 猫外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.3.3 总RNA提取 |
| 2.3.4 FLA Ⅰ基因克隆 |
| 2.3.5 软件及公式 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 FLA Ⅰ基因扩增与鉴定 |
| 2.4.2 FLA Ⅰ基因序列的测定及分析 |
| 2.4.3 FLA Ⅰ等位基因系统进化树分析 |
| 2.4.4 FLA Ⅰ α1、α2和α3各区变异分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 FLA Ⅰ的克隆及其分子特征 |
| 2.5.2 FLA Ⅰα1、α2和α3区氨基酸变异频率的分析 |
| 2.5.3 高变异位点对FLA Ⅰ多肽递呈规律的影响 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 pFLA Ⅰ递呈抗原多肽功能机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 载体与菌株 |
| 3.2.2 引物设计与合成 |
| 3.2.3 多肽的预测与合成 |
| 3.2.4 主要试剂 |
| 3.2.5 仪器设备 |
| 3.2.6 常用溶液及配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 FLA-E~*01801_(-63E/N)和FLA-E~*01801_(-167W/S)表达载体的构建 |
| 3.3.2 FLA-E~*01801_(-63E/N)和FLA-E~*01801_(-167W/S)分子的表达 |
| 3.3.3 FLA-E~*01801_(-63E/N)和FLA-E~*01801_(-167W/S)包涵体的提取 |
| 3.3.4 FLA-E~*01801_(-63E/N)或FLA-E~*01801_(-167W/S)、fβ2m及多肽的体外共复性与纯化 |
| 3.3.5 FLA-E~*01801_(-167W/SRMA-PlD)蛋白结晶 |
| 3.3.6 FLA-E~*01801_(-RMA)和FLA-E~*01801_(-167W/S-RMA-PlD)结构分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 FLA-E~*01801_(-63E/N)和FLA-E~*01801_(-167W/S)胞外区成熟肽表达载体的构建 |
| 3.4.2 FLA-E~*01801_(-63E/N)、FLA-E~*0180_(167W/S)、fβ2m蛋白表达 |
| 3.4.3 FLA-E~*01801_(-167W/s-RMA-PlD)体外复性结果 |
| 3.4.4 FLA-E~*01801_(-167W/S-RMA-PlD)复合物蛋白的结晶、数据收集及结构解析 |
| 3.4.5 FLA-E~*01801_(-RMA9)和FLA-E~*01801_(-167W/S-RMA-PlD)蛋白晶体结构分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 A口袋的限制性 |
| 3.5.2 A口袋限制性因素的分析 |
| 3.5.3 FIV的抗原肽谱 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 pFLA Ⅰ结合基序的鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 随机肽的合成 |
| 4.2.2 FLA-E~*01801、fβ2m蛋白/分子生物学试剂/菌株/仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 FLA-E~*01801、fβ2m及随机多肽的体外复性及纯化 |
| 4.3.2 随机多肽的处理 |
| 4.3.3 色谱分离前样本处理 |
| 4.3.4 LC-MS/MS检测 |
| 4.3.5 高效液相色谱分离 |
| 4.3.6 质谱分析 |
| 4.3.7 多肽统计 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 FLA-E~*01801/fβ2m/随机多肽的体外复性结果 |
| 4.4.2 LC-MS/MS TIC和Base Peak谱图分析 |
| 4.4.3 De Novo数据解析 |
| 4.4.4 随机多肽谱图质量分析 |
| 4.4.5 结合FLA-E~*01801的九肽每一位氨基酸的偏好性分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 家猫CD8αα晶体结构研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 设计引物 |
| 5.2.2 合成编码猫CD8α链胞外区IgSF结构域的基因序列 |
| 5.2.3 菌株及载体 |
| 5.2.4 分子生物学试剂及仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 fCD8α蛋白表达 |
| 5.4.2 fCD8αα蛋白的复性及纯化 |
| 5.4.3 fCD8αα蛋白的结晶条件及晶体外观 |
| 5.4.4 fCD8αα蛋白晶体衍射数据的收集 |
| 5.4.5 fCD8αα蛋白晶体结构解析 |
| 5.4.6 fCD8αα晶体结构分析 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 fCD8αα分子的结构特点 |
| 5.5.2 fCD8αα的CDR1 loop具有刚性特征 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 结论 |
| 第七章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）MHC四聚体技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 MHC四聚体技术 |
| 1.1 MHCⅠ类分子结构基础 |
| 1.2 MHCⅠ四聚体的制备及优化 |
| 1.3 MHCⅡ类分子结构基础 |
| 1.4 MHCⅡ四聚体的制备及优化 |
| 2 MHC四聚体的应用 |
| 2.1 MHCⅠ类分子的应用 |
| 2.2 MHCⅡ类分子的应用 |
| 3 问题与展望 |
（8）鸡MHCI分子呈递病毒多肽的晶体结构及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1 国内外研究进展 |
| 1.1 MHC的发现与命名 |
| 1.2 MHCⅠ和MHCⅡ的结构和功能比较 |
| 1.3 鸡MHCⅠ分子研究进展 |
| 1.4 禽类T细胞表位疫苗的研究进展 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 研究内容与技术路线 |
| 4 研究目标 |
| 第二章 pBF2~*1201复合物晶体的制备 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 表达质粒 |
| 2.2 菌株、载体及蛋白 |
| 2.3 主要生物化学试剂及耗材 |
| 2.4 实验中主要的仪器设备 |
| 2.5 多肽合成与纯化 |
| 2.6 常用溶液及其配方 |
| 3 方法 |
| 3.1 含B12胞外区基因,chβ2m基因原核表达载体构建 |
| 3.2 BF2~*1201、Chβ2m蛋白表达及包涵体提取 |
| 3.3 BF2~*1201、Chβ2m蛋白与多肽体外共复性及纯化 |
| 3.4 pBF2~*1201复合物蛋白的晶体学研究 |
| 4 结果 |
| 4.1 BF2*1201胞外区及Chβ2m表达载体构建 |
| 4.2 PET21a-BF2~*1201与PET21a-Chβ2m蛋白的小量试表达 |
| 4.3 PET21a-BF2~*1201与PET21a-Chβ2m蛋白的大量诱导表达及包涵体纯化 |
| 4.4 BF2~*1201-peptide-Chβ2m体外复性结果 |
| 4.5 BF2~*1201-peptide-Chβ2m复合物蛋白晶体的制备及优化 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 鸡MHCI类分子pBF2~*1201复合物晶体结构研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 3 方法 |
| 3.1 pBF2~*201复合物蛋白晶体X射线衍射与数据收集 |
| 3.2 PBF2~*1201复合物蛋白质结构解析、精修及分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 BF2~*1201-vSRC_(LV8)-Chβ2m及BF2~*1201-A6_(AV9)-Chβ2m复合物蛋白晶体数据收集及结构解析 |
| 4.2 pBF2~*1201复合物晶体结构分析 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 BF2~*1201及人MHCI呈递突变多肽的功能比较研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 载体、菌株及蛋白 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 多肽合成与纯化 |
| 2.5 相关常用溶液的配制 |
| 3 方法 |
| 3.1 HLA-A~*0201及hβ2m蛋白的表达及包涵体提取鉴定 |
| 3.2 BF2~*1201分子与突变多肽的体外共复性及纯化 |
| 3.3 HLA-A2及HLA-A11分子与多肽的体外共复性及纯化 |
| 3.4 复合体蛋白热稳定性分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 HLA-A~*0201及hβ2m蛋白的表达及包涵体纯度鉴定 |
| 4.2 BF2~*1201分子与突变多肽的结合情况分析 |
| 4.3 C端延长多肽同MHCI分子的结合情况分析 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 鸡群中T细胞表位对禽流感Re-6株灭活抗原的免疫辅助功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 抗原及油相 |
| 2.3 候选表位肽 |
| 2.4 HA、HI及Elispot相关试剂及Real-time PCR主要试剂和溶液 |
| 2.5 主要仪器设备 |
| 3 方法 |
| 3.1 疫苗的配制及免疫方案 |
| 3.2 HI实验 |
| 3.3 M2e抗体水平检测 |
| 3.4 Elispot检测免疫鸡群血样中细胞因子表达量 |
| 3.5 Realtime PCR检测免疫鸡群血样中细胞因子转录水平 |
| 4 结果 |
| 4.1 血凝抑制试验结果(HI) |
| 4.2 免疫鸡群血清M2e抗体水平检测 |
| 4.3 免疫鸡群血液中IFN-γ及IL-4表达量检测 |
| 4.4 Realtime PCR检测免疫鸡群血样中细胞因子转录水平 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞数量与功能的检测（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要英文缩写词 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第一章 基于自制关键试剂的aAPC-microplate技术同步检测AST细胞数量和反应活性的方法学论证 |
| 前言 |
| 第一节 H-2K~b/OVA_(257-264)单链三聚体分子的构建、表达与验证 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 利用aAPC-m icroplate同步检测对OVA_(257-264)抗原特异性T细胞的数量和反应活性 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 本章小结 |
| 第二章 HLA-1类等位基因的筛选和重组质粒构建以及HBV特异性抗原表位肽的预测 |
| 前言 |
| 第一节 HLA-A、-B等位基因分型与筛选 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 HLA-A等位基因重链与轻链重组质粒的构建与表达 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三节 HLA-A分子限制性HBV抗原表位肽的预测 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 利用aAPC-microplate技术同步检测HBV抗原特异性T细胞的数量和反应活性 |
| 前言 |
| 第一节 HLA-A2/HBc_(18-27)/HBs_(183-191)单链三聚体的构建、表达与验证 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 aAPC-microplate技术对HBV抗原特异性T细胞数量和功能检测 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）猪MHCI晶体结构及结合IAV和PRRSV表位特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 国内外研究进展 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究内容与技术路线 |
| 1.4 研究目标 |
| 第二章 猪SLA Ⅰ基因克隆及多态性分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 猪SLA Ⅰ优势基因的筛选及表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 黑山猪pSLA-3*hs0202晶体结构与递呈抗原多肽特征 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 藏香猪SLA-1*0501晶体结构及递呈PRRS病毒表位的研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.3 方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 结论 |
| 第六章 结论和创新点 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、可溶性HLA-A2-肽组装复合物的研制及初步鉴定（论文参考文献）
- [1]大蹼铃蟾皮肤分泌物来源的多肽对LPS的中和活性及对MAPK/NF-κB信号通路影响的研究[D]. 郭彩芬. 昆明医科大学, 2021(02)
- [2]使用结构生物信息学方法研究HBV突变在肝癌免疫逃逸中的作用[D]. 顾霜霖. 东南大学, 2020(01)
- [3]HLA-A分子限制性HBV抗原表位肽的预测与鉴定及个性化ELISPOT检测方法的建立[D]. 赵晨. 东南大学, 2019
- [4]胶质瘤相关抗原MAGE-D4 T细胞抗原肽的预测和鉴定[D]. 李申奥. 广西医科大学, 2019(08)
- [5]O型口蹄疫病病毒多表位免疫原和表位嵌合病毒样颗粒研制及其免疫原性评价[D]. 王国强. 河南农业大学, 2018
- [6]家猫pFLA Ⅰ-167W/S和CD8αα精细结构与递呈抗原表位结构机理的研究[D]. 梁瑞英. 中国农业大学, 2018(12)
- [7]MHC四聚体技术研究进展[J]. 邓阳,高顺平,吴国华,张强. 黑龙江畜牧兽医, 2017(17)
- [8]鸡MHCI分子呈递病毒多肽的晶体结构及功能研究[D]. 肖进. 中国农业大学, 2017(07)
- [9]磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板的研制及HBV抗原特异性T细胞数量与功能的检测[D]. 许涛. 东南大学, 2017(02)
- [10]猪MHCI晶体结构及结合IAV和PRRSV表位特性的研究[D]. 樊淑华. 中国农业大学, 2016(05)