一、乙型肝炎病毒C区G87变异对HBeAg分泌的影响（论文文献综述）
刘贺[1]（2020）在《青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究》文中认为目的:分析乙型肝炎病毒（HBV）CD重组体的遗传变异情况;探寻藏族人群HBV感染者血清中表面抗原（HBsAg）和抗表面抗原抗体（HBsAb）双阳性发生率及原因;分析HBV/CD重组体的时空动态传播过程和进化遗传学特征（包括基因序列起源、核苷酸替换率和居群动力学等）。方法:利用多阶段随机抽样的方法,在西藏自治区和青海省海南州进行社区藏族人群血清样本采集,西藏七个地市中共收集HBsAg阳性血清样本852例,青海省收集HBsAg 阳性血清样本411例。按照采样地区藏族人群人口分布情况,选取具有代表性的血清样本进行DNA提取,分别对HBV全长和BCP区采用巢式PCR方法进行扩增、测序和拼接,以获得HBV全序列。对获得的全序列进行重组分析,对不同重组型的基线情况、遗传变异、血清型进行比较;对重组体内不同基因型片段进行系统发育分析。以青藏高原藏族人群HBsAg和HBsAb双阳性血清样本做为观察组,并以1:4配比选择年龄、性别、病毒DNA水平和HBeAg状态同质的HBsAg 阳性/HBsAb阴性血清样本作为对照组,对两组间基因序列S区、PreS区氨基酸突变率、缺失和全基因组核苷酸突变位点分布情况进行比较。使用自NCBI中检索、收集的HBV C2亚基因型、D基因型和CD重组体全长序列,合并本研究中获得的185株全长序列,构建数据库。使用BEAST软件包对CD重组体中的D基因型片段和D1-5亚基因型;CD重组体中的C基因型片段和C2亚基因型分别进行系统发生生物地理学分析。同时,对CD1和CD2全长序列单独进行溯祖分析,并使用贝叶斯skyline重建方法推断种群数量的历史变化。结果:共获得185条HBV全长序列,其基因分型主要为CD重组基因型（181/185,97.84%）,包括:132株CD1型,其nt10-799为D基因型,其余部分为C基因型;49株CD2型,其nt10-1499为D基因型,其余部分为C基因型;除CD重组型,还获得了 4株C2亚基因型序列。185株测序样本中,HBeAg阳性组的病毒DNA水平高于HBeAg阴性组（P=0.001）;HBeAg阴性组年龄高于HBeAg阳性组（P=0.006）。CD1和CD2的C基因型区域均与C2亚基因型最为接近;CD重组体的D基因型段（nt10-799）与D4亚基因型最为接近,而CD2型nt800-1499序列在系统发育树中与D1-D3更为接近。CD2型重组体主要分布于与印度接壤的山南地区和日喀则市（P=0）。CD重组体在S区氨基酸aa76、aa120和aa129与D基因型存在差异。HBV/CD重组体的主要血清学型为ayw2型（175/181,96.7%）。与CD1型相比,CD2型存在较多的S207N突变。HBV/CD重组体的T1762/A1764双突变发生率低于C基因型,与D基因型接近。HBV/CD病毒株的 G1896A（11.1%vs 25.6%）和A2189C（11.1%vs 50.0%）突变频率低于 C2基因型,G1613A（8.9%vs 10.3%）突变水平与C2基因型相近。青藏高原1263份HBsAg阳性样本的双阳性率为2.14%（27/1263）。在S蛋白全长、N端,MHR（aa100-169）,“a”决定簇（aa124-147）,茎环结构第一环（aa124-137）,第二环（aa139-147）和C端的氨基酸突变率,双阳性组均显着高于对照组;双阳性组中PreS区缺失显着高于对照组（以上结果中,均为P<0.001）。PreSI和PreS2氨基酸突变率在两组间无显着性差异（P=0.19;P=0.89）。PreC/C区C2002T、A2159G、A2189C、C2198A在两组间的分布均存在显着差异。双阳性组和对照组的核苷酸点突变比较,PreS/S区C3189A和T825C、P区C930A在两组间分布存在显着性差异。其中,PreS区C129T（S155L）仅存在于对照组;PreS区C3189A（D103E）和S区T825C（V224A）突变仅存在于双阳性组。HBVD基因型和CD重组体中的D型区域（nt10-799）可溯祖至271年前（95%HPD 138-477）的亚洲南部,其平均进化速率约为1.26×104（95%HPD 5.92×10-5-1.93×10-4）/位点/年。D4亚基因型是CD1和CD2中最为接近的分支,于1850年左右（95%HPD 1743-1934）进入青藏高原;1911年左右（95%HPD 1845-1971）分化为CD1和CD2内相应片段。CD1型较CD2型出现更早,表明先形成D基因型区段为nt10-799的CD1,后续形成D基因型区段为10-1499的CD2。HBV/CD1和HBV/CD2重组体分别形成三个独立的进化群。HBV/CD1重组体自1980年代开始至2000年,其种群大小保持稳定;HBV/CD2重组体自1997年首次报道以来,其种群大小经过短暂上升之后,随即出现了明显的下降趋势。全球C2亚型片段的传播最先起源于亚洲东部,首先传播到中国西北和亚洲北部,随后东亚分离株又进一步播散到美洲。结论:HBV/CD重组体是高原地区流行的主要基因型。HBeAg阴性组患者体内重组体DNA水平更高,病毒复制速度较快,病情处于进展期。年龄增长是导致HBeAg在感染HBV/CD的藏族人群血清中发生转阴的主要原因。HBV/CD1重组来源为D4和C2亚基因型;HBV/CD2可能经过重组来源为D1-3、D4和C2亚基因型的多次重组。基于各基因型的地理分布,形成CD重组体的主要重组来源可能为中国（C2亚基因型）和印度（D4亚基因型）。与D基因型相比,HBV/CD重组体的主要血清型无明显变化。HBV/CD重组体感染者均在高海拔地区生活,造成这种现象的可能原因是高原居民具有相近的遗传背景特征或长期的高海拔生活导致其具有相同或相似的生活习惯。青藏高原HBV表面抗原阳性人群中HBsAg和HBsAb双阳性的发生率接近大多数不同基因型的既往研究结果。与对照组相比,双阳性组的氨基酸突变率在S区全长及其内的各个区段均显着增加。S区高突并不是血清双阳性病的充分必要条件,并不能完全解释HBsAg/HBsAb共存现象,PreS区的改变可能是导致HBsAg/HBsAb双阳性的因素之一。S区T825C（V224A）、PreS区C3189A（D103E）仅存在于双阳性组中,这些氨基酸变异导致蛋白结构发生变化,可能是双阳性发生的重要条件。HBVD基因型最可能的起源地是南亚地区。D基因型原型株在18世纪中叶逐步从印度传播到中亚进而传播到欧洲、地中海地区和非洲。在此过程中,19世纪中叶先后分化出D1、D3和D2亚基因型。同时19世纪中叶自印度向东北方向传播,逐步形成D4亚基因型并在1910年左右进入青藏高原及周边地区与C2型发生重组,这与英军两次入侵西藏时间相吻合。欧洲主要HBV D亚型的传播可追溯到二十世纪早期,包括第一次世界大战特别是第二次世界大战在内的一段时期。此过程可能与战争中产生的创伤、输血和疫苗注射,以及有组织的大规模人口迁移导致HBV的快速传播和演化有关。C2基因型向美洲等地的播散则与亚洲在二十世纪八九十年代的欧美移民潮有关,随着大量东亚地区亚裔人口向欧美等发达国家移民导致C2亚基因型的世界范围传播。
戴海梅[2]（2019）在《HBV基因ntA1762T/G1764A及S蛋白I126T联合变异的临床与实验研究》文中提出[目 的]探究BCP区及S区变异和HBsAg、HBsAb双阳的相关性及ntA1762T/G1764A和I126T联合变异对HBV生物学特性的影响。[方 法]本研究第一部分收集共250例慢性乙型肝炎患者的血清样本进行测序,以HBsAg和HBsAb双阳性的123例患者为实验组,仅HBsAg阳性的127例患者作为对照组,比较两组在B基因型和C基因型之间分布的差异、BCP区nt519-853片段和S区nt1655-2014片段的突变情况及联合突变与HBsAg、HBsAb双阳的相关性。第二部分根据第一部分和前期的研究结果,以碱基位点ntA1762T/G1764A双突变和氨基酸位点aaI126T（对应ntT531C突变）突变的联合变异组为实验组,野生型、ntA1762T/G1764A双突变或aaI126T（ntT531C）突变为实验对照组,体外构建含1.2倍HBV基因组的重组质粒,将目的质粒转染进肝癌细胞内表达,检测转染成功后的表达产物水平并分析结果。[结 果]1.在250例HBV感染患者中,单阳组（127例）和双阳组（123例）在年龄、病毒载量HBV-DNA上的差异无统计学意义（t=-0.252,-1.759;P=0.801,0.08）。HBeAg阳性的比例在两组之间的差异也没有统计学意义（χ2=3.029,P=0.082）。但两组在性别上的差异有统计学意义（χ2=6.412,P=0.011）,单阳组的女性多于男性,而双阳组的比例相反。两组之间的ALT、AST检测值的差异也有统计学意义（z=-2.921,-2.890;P=0.003,0.004）。2.单阳组和双阳组在B和C基因型之间的差异无统计学意义（χ2=2.728,P=0.099）。3.在所测的基因片段中,C基因型中在单阳组和双阳组之间的差异具有统计学意义的碱基突变位点为 T531C/A/G、T813G、A1762T 和 G1764A（χ2=7.23,4.81,7.57,9.70;P=0.007,0.028,0.006,0.002）,其中 T531C/A/G 和 T813G 对应氨基酸变异为I126T/N/S和F220C。并且A1762T/G1764A双突变在单阳组及双阳组之间的差异是有统计学意义的（χ2=8.25,P=0.004）。4.在所测的基因片段中,B基因型中在单阳组和双阳组之间的差异具有统计学意义的碱基突变位点为A519G和A1762T（P=0.033,0.03）,A519G对应氨基酸变异为K122R。G1764A和A1762T/G1764A双突变在B基因型的单阳组和双阳组间的差异无统计学意义（χ2=3.62,P=0.057）。5.在本实验测序的C基因型样本中,T531C/A/G、T813C/G、A1762T、G1764A四个位点的突变及A1762T/G1764A双突变的突变率在HBeAg阳性组和HBeAg阴性组之间的差异没有统计学意义（P=0.601,0.718,0.536,0.601,0.359）。6.分析联合变异时,C基因型中,与野生型相比,531位点的突变、1762/1764双突变和联合突变组都有更高的双阳发生率,差异有统计学意义（用FDR校正的P值分别为0.036、0.036、0.036）,而各个变异组之间的双阳率差异不明显。7.设A组为T531C突变组,B组为A1762T/G1764A突变组,C组为野生型,Y组为联合突变组。两次转染实验中,联合突变的Y组在转染24小时的上清和转染48小时后的上清中HBsAg或HBeAg的检测值均比A、B、C组的检测值要高于2倍以上;而A、B、C组三组之间比较差异均不明显。联合突变的Y组细胞内HBsAg的检测值虽然也比A、B、C组的检测值高。而细胞内HBeAg在四个组中的检测值均很低（0.06～0.07 PEIU/mL）。8.两次转染实验中,Y组在转染24小时的上清和细胞内的HBV-DNA检测值比A、B、C组的检测值高,但差异不明显。A、B、C组之间的差异也不明显。Y组在转染24小时的上清的HBV-DNA检测值比A、B、C组的检测值高,在转染48小时的上清中却比B、C组的低,比A组的高。[结 论]1.ALT和AST在单阳组（127例）和双阳组（123例）之间的差异有统计学意义,说明双阳组中的肝脏炎症表现的更为严重。2.在本实验样本中,单阳和双阳的发生概率在B和C基因型患者之间没有明显不同。3.T531C/A/G、T813G、A1762T、G1764A 突变和 A1762T/G1764A 双突变在C基因型的单阳组和双阳组之间的差异具有统计学意义,说明这些突变与HBsAg、HBsAb的双阳性有关。4.双阳的发生率在T531C突变、A1762T/G1764A双突变和联合变异组之间的差异不明显。5.在体外转染细胞试验中,T531C联合A1762T/G1764A突变组比野生型和单一突变组有更高的HBsAg和HBeAg检测值,说明联合变异可使HBV蛋白表达和分泌能力增强。该联合变异使HBV复制能力增强的结果不明显。
陈伟[3]（2017）在《HBV-DNA突变和细胞因子与HBV相关肝硬化和肝癌的相关性研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的肝硬化及肝细胞癌仍是威胁全球人类健康的主要疾病,我国HBV感染人群达1.3亿,约15%-25%由于HBV感染相关性的疾病而死亡。对HBV高危病人早期诊断,早期发现,及时采取措施进行干预,对改善肝硬化、肝癌预后具有重要意义。目前认为HBV的基因突变及宿主体内免疫功能的改变在HBV相关的慢性肝病发生和发展中起重要作用。本研究的目的是分析HBV DNA突变以及相关的细胞因子的变化与肝硬化和肝癌的相关性,以期发现新的致病分子靶点,为将来特异性治疗HBV诱导的慢性肝病提供实验依据。研究方法1.临床实验:对象为127例慢性乙型肝炎、65例肝硬化和45例肝癌且有HBV感染证据的患者。用DNA测序法、错配扩增突变PCR法分析血清中HBV核心启动子（BCP）区T1762/A1764和前C区A1896突变情况,PCR-荧光探针法检测HBVDNA载量,用酶联免疫吸附法检测血清中细胞因子水平,用免疫组化法检测癌旁组织内细胞因子的表达定位,用realtime PCR法检测细胞或组织内分子基因的表达水平,部分指标间进行相关回归分析。2.细胞水平实验:用CCL5siRNA转染人肝癌细胞株HepG2后,用划痕实验及Transwell法观察细胞的迁移活性和能力,用Western blotting法检测蛋白表达。结果1.HBV前C区和BCP区突变与慢性肝病之间关系研究:（1）HBV的BCP区 A1762T/G1764A 和前 C 区 G1896A 的发生率（62.48%（148/237）、62.48%（148/237）和 49.79%（118/237））高于其它位点,且 A1762T 和 G1764A 是联合发生的;（2）A1762T/G1764A 和 A1762T/G1764A/G1896A 可促进 HBeAg 的转化,增加血清AFP的表达,与肝硬化和肝癌发生密切相关;（3）A1762T/G1764A突变与患者肝癌发生率呈正相关;（4）G1896A可增加HBV-DNA的复制。2.血清细胞因子和HBV相关肝硬化/肝癌的相关性研究:（1）慢乙肝病人血清中HA、LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ含量都非常显着的低于失代偿期肝硬化病人（P<0.001）;（2）CCL5、MIP-1b和HA三种因子在区分肝硬化和慢乙肝病人准确性的ROC曲线显示三种因子的AUC分别为0.8011、0.706和0.752,AUC值均大于0.7,因此,CCL5、MIP-1b和HA在区分肝硬化和慢乙肝病人中都有效,其中,CCL5准确性最高,HA次之,MIP-1b最差。3.CCL5及其受体在肝细胞肝癌中的功能研究:（1）CCL5和CCR5在肝癌组织中大量表达,明显高于肝硬化组织;（2）CCR5特异性siRNA可明显下调肝癌细胞系HepG2中CCR5转录水平;（3）特异性下调CCR5的表达后,进行划痕实验,第24小时观察到,对照组约50%的划痕被细胞迁移而修补,而CCR5siRNA转染组细胞则只迁移修补划痕的23%;（4）Transwell实验中,迁移的细胞数量在对照组为68.73±4.024,CCR5siRNA组降低至24.53±2.545（P<0.001）。结论1.HBV前C区和BCP区突变,改变了病毒的复制能力,与肝硬化和肝癌发生发展密切相关。2.血清中CCL5、MIP-1b和HA水平,尤其是CCL5,可做为判断肝硬化和慢乙肝病情的指标。3.CCL5及其受体在肝癌组织中表达明显增高,在肝癌细胞的迁移和侵袭过程中起重要作用。
陈静娜[4]（2017）在《乙型肝炎病毒核心蛋白区变异与隐匿性乙型肝炎病毒感染的相关性研究》文中研究说明研究背景隐匿性乙型肝炎病毒感染（occult hepatitis B virus infection,OBI）是指患者血清HBsAg阴性,肝组织HBV DNA阳性（伴或不伴有血清HBV DNA阳性）。若患者血清中HBV DNA阳性,HBV低水平复制,HBV DNA<200IU/ml。OBI不仅可以通过输血、器官移植和透析等方式传播HBV,而且与肝硬化和肝细胞癌的发生密切相关。乙型肝炎病毒核心蛋白具有多种功能,在pgRNA和pol多聚酶的衣壳化、核衣壳的解离和聚合、病毒颗粒的成熟中具有重要的作用。OBI的发生与HBV的基因突变密切相关,现有的研究主要针对HBV的S区和BCP区的变异,乙型肝炎病毒核心蛋白区（C区）变异在OBI的发生发展中的作用机制目前仍不清楚。研究目的探索乙型肝炎病毒核心蛋白区（C区）变异在隐匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）中的作用。研究方法本研究通过重叠延伸PCR和定点突变PCR技术构建含有不同突变位的乙型肝炎病毒核心蛋白区突变型质粒,通过细胞免疫荧光检测肝组织HBcAg的分布情况,western blot检测HBcAg表达水平,化学发光法检测HBsAg和HBeAg的表达水平,免疫组织化学检测小鼠肝组织HBcAg的表达情况,RT-PCR检测小鼠肝组织中HBV RNA的水平。实验结果利用重叠PCR和定点突变技术成功构建单点、双联和三联突变的OBI毒株和野生株。HBcAg在HuH7细胞有三种不同分布类型。A类包括wt、SZB、SZA-R62W、wt-P50H、wt-L55I、wt-W62R、wt-S74G、wt-S87G、wt-L95I、wt-I97L、wt-T142M、wt-T147A、SZA-H50P/R62W、SZA-P50H/R62W/G74S、SZA-R62W/G74S、wt-P50H/L95I;B 类包括 SZA、SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-G74S、SZA-G87S、SZA-I95L、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T;C 类包括 wt-P50H/W62R、wt-P50H/W62R/S74G、wt-P50H/W62R/S87G、wt-P50H/W62R/T147A、wt-W62R/L95I。OBI 毒株 SZA、SZA-G87S、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T、wt-P50H/W62R/S74G 的 HBcAg 表达水平低于野毒株,SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-R62W、SZA-G74S、SZA-I95L 的 HBcAg 表达水平高于 SZA 的 HBcAg 表达水平。OBI毒株SZA和SZB胞内和胞外HBeAg水平低于野毒株。OBI毒株SZA的 5 个单点回复突变 SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-R62W、SZA-G74S、SZA-I95L可轻度提高胞内和胞外HBeAg水平,SZA的4个单点回复突变SZA-G87S、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T对其无明显影响。SZA的双联和三联回复突变的HBeAg表达水平要高于单点回复突变。野毒株的单点突变wt-P50H和wt-W62R 可降低 HBeAg 水平,而双联突变 wt-P50H/W62R、wt-W62R/L95I,三联突变 wt-P50H/W62R/S87G、wt-P50H/W62R/T147A 的 HBeAg 表达水平低于野生型的单点突变。OBI毒株SZA在Balb/c小鼠肝组织不表达HBcAg,SZB在肝组织表达HBcAg。野毒株在肝组织表达HBcAg,分布类型为Ⅲ型。OBI毒株SZA的8个单点回复突变 SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-G74S、SZA-G87S、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T不表达HBcAg。单点回复突变SZA-R62W,双联回复突变 SZA-H50P/R62W、SZA-R62W/G74S,三联回复突变 SZA-P50H/R62W/G74S可提高HBcAg的表达水平。野毒株的单点、双联、三联突变不影响HBcAg的表达水平。Balb/c小鼠血清中,OBI毒株SZA的8个单点回复突变SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-G74S、SZA-G87S、SZA-I95L、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T的HBeAg表达水平差异不明显,SZA的单点回复突变SZA-R62W能显着提高HBeAg的表达水平。野毒株的单点突变wt-P50H、wt-W62R,双联突变 wt-P50H/W62R、wt-W62R/L95I,三联突变 wt-P50H/W62R/S87G、wt-P50H/W62R/T147A的HBeAg表达水平低于野毒株其它位点的单点突变。第1周和第7周,SZA在小鼠肝组织始终不表达HBcAg。第1周,wt在小鼠肝脏中表达HBcAg,并且在第7周HBcAg的表达水平明显上升。第1周,小鼠肝脏中SZA的HBV total RNA和C region RNA水平均低于野毒株。第七周,小鼠肝脏中SZA的HBV total RNA和C region RNA均高于野毒株。OBI毒株SZA的HBeAg长期处于低表达水平（10-15 S/CO）。野毒株HBeAg长期处于高表达水平（500-1500 S/CO）。OBI毒株的C区的P50H、W62R、S74G、S87G、L95I的联合变异改变HBcAg、HBeAg、HBV RNA的表达水平,其中W62R起着最关键的作用。乙性肝炎病毒C区变异对OBI的形成具有重要作用。结论OBI毒株的C区的P50H、W62R、S74G、S87G、L95I的联合变异改变HBcAg、HBeAg、HBV RNA的表达水平,其中W62R起着最关键的作用。乙性肝炎病毒C区变异对OBI的形成具有重要作用。
舒格拉·哈比丁[5]（2016）在《中药联合阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎的疗效预测分析》文中研究说明目的:对中药联合阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎的48周疗效的影响因素进行分析,筛选出其中与48周疗效相关的预测因素,并对其预测价值进行评价,为临床上治疗结局疗效的预测提供一些可以借鉴的依据。方法:以“十一五”国家科技重大专项课题“慢性乙型肝炎证候规律及中西医结合治疗方案研究（ALT≥2×ULN部分）”的560例病例资料为研究对象进行回顾性研究。1.采用卡方检验的的方法,对FAS数据集人群总体以及试验组、对照组分别进行基线、治疗12周、治疗24周对应的ALT、HBV DNA、HBeAg等指标对48周HBeAg转阴、HBeAg血清学转换、HBV DNA转阴以及完全应答情况等治疗结局影响的分析。2.对HBeAg转阴、未转阴人群特点进行分析采用卡方检验,得出各时点48周HBeAg转阴或者血清学转换的可预测比率。采用秩和检验的方法对试验对照组、HBeAg转阴、未转阴人群,各时点HBeAg、ALT进行分析。3.应用Logistic回归进行多因素分析,分析中药干预与否、是否母婴传播、性别、年龄、基线ALT、基线HBeAg及基线HBV DNA水平、治疗12周相关指标、治疗24周相关指标、基线到治疗12周或24HBeAg下降幅度等对于疗效结局（包括48周HBeAg转阴、HBeAg血清学转换、HBV DNA转阴和完全应答）的影响,筛选出与疗效结局相关的独立影响因素。4.应用ROC曲线分析法,对Logistic分析筛选出的影响因素进行预测价值的评价,得出疗效预测能力较强的预测因素及模型。结果:1.在治疗前基线高水平ALT、低水平HBV DNA载量、低水平HBeAg、治疗12或24周发生ALT复常、HBV DNA转阴、HBeAg转阴的患者在治疗结束时能得到更好的疗效。2.无论FAS人群总体、试验组还是对照组,12至24周HBeAg转阴人数占48周HBeAg总转阴人数的率、HBeAg转阴人数占48周HBeAg总血清学转换人数的率有升高趋势;治疗早期获得HBeAg转阴人群治疗至48周HBeAg保持转阴率、血清学转换率高于其他时点,试验组HBeAg保持转阴率均高于对照组,HBeAg血清学转换率试验组低于对照组;试验组、对照组在治疗12周、24周、36周ALT上、治疗12周HBeAg上差异有统计学意义（P<0.05）;48周 HBeAg转阴、未转阴人群在各时点ALT、HBeAg水平上差异有统计学意义（P<0.05）。3.影响HBeAg转阴的独立因素有中药干预、非母婴传播、基线HBeAg低水平、治疗12周ALT复常、治疗24周HBV DNA转阴以及基线到治疗12周或24HBeAg下降幅度大等;影响HBeAg血清学转换的独立因素有使用中药干预、非母婴传播、基线HBeAg低水平、治疗12周ALT复常、治疗24周HBV DNA转阴以及基线到治疗12周或24周HBeAg下降幅度大等;影响HBV DNA转阴的独立因素有基线高ALT水平、低水平的HBeAg、低水平的HBV DNA、治疗12周或24周ALT复常以及基线到治疗12周或24周HBeAg下降幅度大等;影响完全应答的独立因素有年龄低、基线低水平的HBeAg、治疗24周ALT复常、治疗24周HBV DNA转阴以及基线到治疗12周或24HBeAg下降幅度大等。4.中药干预与否、基线HBeAg水平,治疗12周ALT、治疗24周HBV DNA、基线到治疗12周HBeAg下降幅度,对48周HBeAg转阴有预测价值;基线HBeAg水平、治疗12周ALT、治疗24周HBV DNA、基线到治疗12周HBeAg下降幅度,对48周HBeAg血清学转换有预测价值;基线HBV DNA水平、基线HBeAg水平、基线ALT水平、治疗12或24周ALT、基线到治疗12周或24周HBeAg下降幅度,对48周HBV DNA转阴有的预测价值;年龄、基线HBeAg水平、基线到治疗12周HBeAg下降幅度、治疗24周HBV DNA、治疗24周ALT,对48周完全应答有预测价值。结论:①无论试验组还是对照组,基线高水平ALT、低水平HBV DNA、低水平HBeAg可作为48周HBeAg、HBV DNA双转阴的有利预测因素。②无论试验组还是对照组,12周或24周发生ALT复常、HBV DNA转阴、HBeAg转阴的患者在治疗结束时容易获得更好的疗效。③趋势上,治疗早期获得HBeAg转阴人群治疗至48周HBeAg保持转阴率高于其他时点,中药干预组HBeAg保持转阴率高于对照组。④中药干预在48周HBeAg转阴方面疗效优于单纯用阿德福韦酯治疗。⑤中药干预与否是48周HBeAg转阴重要的预测因素,此外母婴传播、年龄,基线ALT、HBeAg以及HBV DNA水平、治疗12周或24周的ALT、HBeAg、HBV DNA以及HBeAg下降幅度等是结局疗效的重要预测因素,其中治疗12周或24周的HBeAg为较好的预测因素。⑥多因素联合的预测模型的预测价值优于单因素预测价值。治疗24周指标整体的预测价值高于治疗12周指标的预测价值,但考虑到临床上的治疗时限问题,12周治疗早期的疗效预测更具有临床实用价值。⑦治疗12周年龄<30.5岁（针对于本研究18～65岁人群）、基线HBeAg水平<547.950 S/CO时,HBeAg水平12周下降幅度差值>0.31,48周更可能实现完全应答。⑧治疗24周年龄<30.5岁（针对于本研究18～65岁人群）、基线 HBeAg<547.950 S/CO、治疗 24 周 ALT<51.2IU/L,治疗 24 周 HBV DNA<3.7log10IU/ml的患者48周更可能实现完全应答。
吴书志[6]（2015）在《海洋天然活性小分子物质抗乙肝病毒效果筛选研究》文中研究说明目的:乙型病毒性肝炎是我国的常见病,严重威胁居民的生命和健康。遗憾的是,目前对乙肝的治疗依然缺乏非常有效的药物。海洋是地球的重要组成部分,生活在海洋的生物可能具有多种抗病功效,本研究尝试对从海洋生物提取的20种天然小分子物质进行体外抗乙肝病毒效果评价,希望能筛选到一些可能具有抗乙肝病毒作用的物质。方法:1、本研究拟评价的20种海洋小分子物质来由广西北部湾海洋研究所提供,这20种化合物分别是:8-甲基-环（S-脯氨酸-R-亮氨酸）,分子式:C20H30O4简称B2;邻苯二甲酸二（2-丙基）戊酯,分子式:C24H3804简称B3;环（脯氨酸-亮氨酸）分子式:C11H18N202简称B4;2-（4-氨基苯）乙醇,分子式:C8H11NO简称B7;8-甲基-环（S-脯氨酸-R-亮氨酸）,分子式:C12H20N2O2简称B7;胆甾醇,分子式:C27 H460简称S1;胸腺嘧啶,分子式:C5H6N202简称S3;腺嘌呤,分子式:C6H6N402简称S5;尼克酰胺,分子式:C6 H6 N2 O简称S7;对羟基苯甲酸,分子式:C7H603简称S8;2-羟基脯氨酸-亮氨酸,分子式:C11H18N203简称H1;4-羟基脯氨酸-α-氨基苯乙酸),分子式:C13H14N203简称H2;甘氨酸-2-氨基丁酸,分子式:C6H10N202简称H3;甘氨酸-亮氨酸,分子式:C8H14N202简称H4;甘氨酸-L-脯氨酸,分子式:C7H10N203简称H5;D-脯氨酸-L-缬氨酸,分子式:C10H16N202简称H6;脯氨酸-亮氨酸,分子式:C11H18N202简称H7;4-羟基脯氨酸-亮氨酸,分子式:C11H18N203简称H10;4-羟基脯氨酸-苯丙氨酸,分子式:C14H16N203简称H7;L-2-羟基脯氨酸-苯丙氨酸,分子式:C14H16N203简称H12。2、本研究用来评价海洋小分子物质抗乙肝病毒作用的体外系统为HepG2.2.15细胞系:HepG2.2.15细胞出现贴壁后,观察6天内其培养上清液中的HBsAg和HBeAg出现生长及分泌情况,一切正常后视为模型建立成功。3、海洋天然活性小分子物质对HepG2.2.15细胞的毒性作用的评价方法:将小分子物质配置成 20mM,10mM,5mM,2.5mM,1.25mM,0.625mM 6个浓度梯度,将拉米夫定（阳性药物对照）配制成1mM;HepG 2.2.15细胞以1×107个/L接种于96孔培养板,等待细胞贴壁,然后分别将不同浓度组及正常组药物置入不同含药培养液。加药培养6天后,吸去上清液,加5g/LMTT20μL,在37℃孵育4h,震荡10min,测A490nm值,之后通过计算得到细胞抑制率和TC50。4、细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的测定方法:将选取的20种化合物用DMSO溶解后再以1640完全培养液培养液稀释,分别配制成20mM,10mM,5mM,2.5mM,1.25mM共5个浓度梯度（DMSO终浓度不超过0.1%）,同时设阴性对照组（仅加细胞培养液）和阳性对照组（1mM拉米夫定）,每组设3个复孔。经传代后取对数生长期状态良好的细胞,调整细胞浓度为1×107个/L,接种于96孔板,每孔200μL,培养箱培养24h,待细胞贴壁后各药物浓度组换入相应含药培养液,阴性对照组换入正常培养液,分别收集贴壁后d3和d6的细胞培养上清,-20℃保存,ELISA法对第3、6天上清液中HBsAg和HBeAg进行检测,出现显色反应后,利用酶标仪读取A450nm值;然后通过公式计算,得到抗原抑制率和50%药物抑制浓度（IC50）。5、细胞培养上清液中HBVDNA的测定。按照实验方法4得到第3、6天上清液,按照HBVDNA定量测定PCR试剂盒说明书进行常规操作。得到HBV DNA定量的结果,计算HBV DNA抑制率和IC50。结果:1、HepG2.2.15细胞出现贴壁后,6天内其培养上清液中的HBsAg和HBeAg出现生长及分泌情况稳定增长。2、0.625mM的化合物对细胞的抑制与阴性对照组差异无统计学意义;20mM的化合物和1mM拉米夫定组在细胞毒性上差异无统计学意义。3、小分子化合物对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用:本研究共评价了 20种海洋天然小分子化合物。其中H5大于2.5mM浓度以上在d3和d6上清液中的HBsAg与阴性对照组的差异均具有统计学意义;H5大于2.5 mM浓度以上在d3和d6上清液中的HBeAg与阴性对照组的差异均具有统计学意义（P<0.05）。第6天,H5对HbsAg和HbeAg的IC50分别为11.6mM和12mM,其TI分别为2.1和2;H10大于2.5mM浓度以上在d3和d6上清液中的HBsAg与阴性对照组的差异均具有统计学意义;H10大于2.5 mM浓度以上在d3和d6上清液中的HBeAg与阴性对照组的差异均具有统计学意义（P<0.05）。第6天,H5对HbsAg和HbeAg的IC50分别为9.9mM和12mM,其TI分别为2.5和2.1;H12大于1.25mM浓度以上在d3和d6上清液中的HBsAg与阴性对照组的差异均具有统计学意义;H12大于2.5 mM浓度以上在d3和d6上清液中的HBeAg与阴性对照组的差异均具有统计学意义（P<0.05）。第6天,H12对HbsAg和HbeAg的IC50分别为8.74mM和7.7mM,其TI分别为2.7和2.4。4、海洋小分子物质对HBVDNA分泌的抑制作用:在所研究的20种海洋天然小分子化合物中,发现H5在大于2.5mM浓度以上在d3和d6上清液中的HBV DNA与阴性对照组的差异均具有统计学意义,（P<0.05）。第 6 天,H5 对 HBV DNA 的 IC50 为 11.5mM,其 TI为2.1;H10大于5mM浓度以上在d3和d6上清液中的HBV DNA与阴性对照组的差异均具有统计学意义。（P<0.05）第6天,H10对HBVDNA的IC50为9.9mM,其TI为2.5;H12大于1.25 mM浓度以上在d3和d6上清液中的HBV DNA与阴性对照组的差异均具有统计学意义。（P<0.05）第6 天,H12 对 HBVDNA 的 IC5 为 8.6mM,其 TI 为 2.73。结论:1、我们所建立的HepG2.2.15细胞系具有稳定的分泌HBsAg和HBeAg的作用,而且随着时间其分泌作用也在增长。2、所有20种海洋天然活性小分子物质对HepG2.2.15的细胞毒性作用不明显。3、通过对20种海洋天然小分子化合物筛选,得出H5、H10、H12三种化合物具有抗乙肝病毒活性,且随着药物浓度的增加,其对HepG2.2.15细胞培养上清液分泌HBsAg、HBeAg及HBVDNA抑制作用也增加,呈一定剂量反应关系。
杨贵奉[7]（2014）在《乙型肝炎病毒基因型及基因变异与慢加急性肝衰竭间的关系及其可能的致病机制》文中研究指明研究背景：乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染呈世界性流行,据报道,全球有20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿为慢性感染者。而我国的慢性HBV感染者有9300万,其中慢性乙型肝炎患者有2000万。HBV感染可以引起,从无症状携带到急性肝炎（acute hepatitis B, AHB）、慢性肝炎（chronic hepatitis B, CHB）、肝硬化、肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）以及肝衰竭等一系列疾病谱。其中,慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure, ACLF）:在慢性肝病基础上出现病情的急性加重,临床表现多样并且死亡率高,根据亚太肝病学会最新的定义,ACLF是指“在之前已诊断或尚未诊断的慢性肝病基础上,出现黄疸和凝血功能障碍的急性肝脏损害,并且在发病4周内并发腹水和/或肝性脑病”。在我国,90%以上的ACLF病例存在HBV感染,称之为乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭（Hepatitis B related acute-on-chronic liver failure, HB-ACLF）。相对于庞大的HBV感染人群,HB-ACLF的发生率虽然相对较低,但患者病情重,治疗费用高,预后不良,死亡率高达50-90%,肝移植是唯一有效的临床治疗手段,但目前供体来源异常缺乏,一般患者常常难以实现。HB-ACLF的发生机理目前仍不明确。一般认为,病毒和宿主两方面的因素都参与了HB-ACLF的发生。来自日本的几项研究发现,HBV Bj （B1）基因亚型与暴发性肝炎（Fulminant hepatitis, FH）的发生相关。另外,多项研究显示,前C基因区（PC）和C基因启动子区（BCP）的变异与FH的发生相关。体外研究结果显示,这些病毒变异可能通过增强HBV的复制能力和／或下调HBeAg的表达而引起肝炎急性加重或重症化；然而,来自亚洲以及欧洲的几项小样本量调查研究未发现HBV BCP/PC变异与FH的发生相关。在中国,ACLF发生率较FH高,其临床症状也不同于FH,后者在AHB的基础上发生。近年来,国内不同地区的几个研究小组对HBV基因型及基因变异与ACLF间的关系进行了探索,结果不尽相同。来自北京302医院的Ren等发现,与其他CHB患者相比,基因型B、T1753V （C/A/G）、A1762T、G1764A, G1896A和G1899A位点变异在ACLF患者中更为多见。我们之前的研究发现,与其他CHB患者相比,基因型B在ACLF患者中更为多见；在基因型B中,A1762T/G1764A, A1846T及G1896A位点变异率高于其他CHB患者。在病毒基因变异发生率方面,类似结果在其他的研究中也有报道,但未发现基因型B与ACLF目关。另外,Yan等从纵向和横向两个方面对二者的关系进行探索,发现在纵向研究中,A1846T和G1896A位点变异与ACLF相关；在横向研究中,A1846T和C1913A/G位点变异与ACLF相关,但均未发现基因型B与ACLF相关。因此,HBV基因型B是否与HB-ACLF的发生相关,哪些常见的位点变异与lHB-ACLF的发生相关,目前存在争议。考虑到这些研究均为单个中心研究,HBV的基因型分布存在地域差异,在中国的北方地区,以基因型C为主；而在中国的南方地区基因型B更为多见,而不同的基因型中位点变异率的发生情况也存在差异,因此,需要一个多中心的研究来阐明HBV基因型及基因变异与ACLF间的关系。另外,这些因素是如何来发挥作用诱导疾病的产生的,目前也不十分清楚。体外研究显示前C/C基因启动子区的变异可增强HBV复制活性,或/和影响HBeAg水平的表达,因此推测这些变异或许通过这两种途径在肝衰竭的发生中发挥重要作用。但是也有研究发现,C/C基因启动子区的变异对HBV复制活性无明显影响。因此,关于前C/C基因启动子区的变异对病毒生物学特征的影响也存在争议,需要进一步的验证。本研究通过对HB-ACLF、重度和轻度慢性乙型肝炎患者（CHB-S和CHB-M）的血清中病毒学特征进行比较分析,阐明HBV基因型及哪些基因变异与慢加急性肝衰竭的发生有关,并以此为基础,构建相应的不同基因型、含有不同变异模式的重组质粒转染Huh7细胞进行体外研究,对这些因素可能的致病机理进行初步探讨。第一章乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭患者的血清中病毒学特征分析目的：比较分析来自多中心HB-ACLF、重度和轻度慢性乙型肝炎患者（CHB-S和CHB-M）的血清中病毒学特征,阐明HBV基因型及哪些基因变异与HB-ACLF的发生有关。方法：自2011年1月至2012年6月,本研究共收集来自中国的南部、东部、西部和中部4个中心的522例患者的血清标本,广东省215例、浙江省147例、四川省100例、湖北省60例；其中包括CHB-M患者231例、CHB-S患者84例、HB-ACLF207例。所有纳入的患者,其血清HBsAg日性的持续时间均大于6个月。HB-ACLF患者的纳入标准为：（1）血清总胆红素（TBIL）>171.1μmol/L;（2）凝血酶原活动度（PTA）<40%；和（3）在慢性肝病的基础上急性起病,并且在4周内出现腹水和/或肝性脑病。CHB-S患者的纳入标准为：（1）血清TBIL>85.5μmol/L;或（2）PTA>40%,但≤60%；或（3）血清白蛋白（ALB）<32g/L；不足以诊断为HB-ACLF。CHB-M患者的纳入标准为：（1）血清谷丙转氨酶（ALT）>80U/L;和（2）血清TBIL<85.5μmol/L.所有患者均排除以下情况：（1）合并有丙、丁、戊型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒的感染；或（2）合并恶性肿瘤；或（3）自身免疫性疾病。血清标志物检测采用化学发光免疫分析仪进行,HBV DNA水平通过罗氏实时荧光定量PCR系统进行检测,检测范围为1×103-1×109copies/ml。肝功能检测包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）等。提取血清中的HBV DNA并进行PCR扩增,采用巢式PCR法分别扩增S基因和BCP/PC/C区序列,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,再用ABI3730测序仪进行序列测定。用MEGA5软件对获得的测序结果进行排列,并与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中的A-G7种HBV基因型参考序列进行比对,S基因区序列用于基因分型,BCP/PC/C区序列用于分析不同变异位点发生频率以及与基因型的相关性。数据的统计学处理采用SPSS16.0软件,患者资料中,计量资料采用One-way ANOVA或Kruskal-Wallis H检验进行分析；计数资料构成比采用卡方检验（Pearson chi-square检验或Fisher’s Exact检验）,多因素分析采用二分类logistic逐步回归分析法。双侧P值<0.05为统计学差异有显着性。结果：1)三组患者的临床特点。性别在CHB-M、CHB-S和HB-ACLF三组患者中的差异无显着性（P=0.200）。年龄（F=28.869,P<0.001）在三组患者中的差异有统计学意义,且以慢加急性肝衰竭患者最为年长。ALT （χ2=35.272, P<0.0011）、 AST （χ2=114.053, P<0.001）及TBIL （χ2=374.139, P<0.001）水平在CHB-M、 CHB-S和HB-ACLF三组患者中依次逐渐升高,差异有统计学意义。而ALB（χ2=240.366,P<0.001）水平以及HBV DNA （F=22.808, P<0.001）和HBeAg阳性率（χ2=10.752,P=0.005）在CHB-M、CHB-S和HB-ACLF患者中依次逐渐降低,差异有统计学意义。2)三组患者的基因型分布。基因型B在CHB-M, CHB-S和HB-ACLF三组患者中所占的比例分别为49.8%（115/231）,52.4%（44/84）和79.2%（164/207）,依次逐渐升高；基因型C所占的比例分别为50.2%（116/231）,47.6%（40/84）,20.8%（43/207）,依次逐渐降低；基因型分布在三组患者间的差异有统计学意义（χ2=43.948,P<0.001）。3)各省的患者基因型分布。在四川和湖北省,以B基因型为主；浙江省患者基因型C更为多见；在广东省,B和C基因型感染者的比例相当。在四川和湖北省中,HB-ACLF患者感染B基因型的比例高于CHB患者（84.1%vs73%和90.3%vs82.8%）,但是差异无显着性（P=0.178和P=0.465）；在广东和浙江省中,HB-ACLF患者感染B基因型的比例显着高于CHB患者（84.6%vs60.6%和48.6%vs22.3%）,差异有统计学意义（分别为χ2=13.492,P<0.001；χ2=9.004,P<0.001）。4) HBV BCP/PC/C区变异发生率在患者组间的比较。A1762T/G1764A、 A1846TG1896A、C1913A/G和A2159G六个位点变异发生率在三组患者间的差异均有统计学意义,且A1762T/G1764A （x2=10.268, P=0.006）、A1846T（χ2=29.422,P<0.001）和G1896A（χ2=31.317,P<0.001）变异在CHB-M, CHB-S和HB-ACLF三组患者中的发生率依次逐渐升高。其余五个位点T1753V、C1766T、T1768A、G1862T和G1899A变异的发生率均较低,且在三组患者间无显着性差异（P>0.05）。5) HBV BCP/PC/C区变异发生率在B和C两种基因型间不同,A1846T（χ2=22.812, P<0.001）、G1896A（χ2=47.359,P<0.001）和C1913A/G（χ2=21.506,P<0.001）变异在B基因型的发生率显着高于C基因型；而T1753V（χ2=18.596,P<0.001）、A1762T/G1764A（χ2=30.980, P<0.001）和C1766T（χ2=9.992,P=0.002）变异在C基因型中的发生率显着高于B基因型。T1768A、G1862T、G1899A和A2159G位点变异率在两种基因型间差异无统计学意义（P>0.05）。6) HBV BCP/PC/C区变异发生率根据基因型分组后,在患者组间的比较。在基因型B中,A1762T/G1764A （χ2=20.078, P<0.001）、A1846T （χ2=14.502,P=0.010）和G1896A （χ2=9.286,P=0.010）变异率在三组患者间差异有统计学意义,且A1762T/G1764A和G1896A变异在HB-ACLF患者中最多见。在基因型C中,除上述四个位点变异外,C1913A/G （χ2=10.610, P＝0.005）和A2159G（χ2=6.426,P=0.040）变异率在三组患者间的差异也有统计学意义,且所有位点变异在HB-ACLF患者中最多见。7) HBV BCP/PC/C区变异率较高的六个变异在不同年龄组的发生率。整体上看,A1762T/G1764A, A1846T和G1896A位点的变异率在CHB患者中随着年龄的增长而逐渐增加,但这种上升趋势在HB-ACLF患者中不明显,另外这四个位点在绝大多数年龄组中,其在HB-ACLF患者的变异率高于CHB患者,尤其是在年龄小于30岁的患者中。HB-ACLF患者中C1913A/G和A2159G变异,在绝大多数年龄组的发生率均高于CHB患者,并且这两个变异的发生率并未随着年龄的增长而升高。且仅在基因型B中,A1762T/G1764A （x2=13.569,P=0.004）、A1846T （x2=14.139, P=0.003）和G1896A （x2=8.434,P=0.038）位点变异率在CHB患者组以及C1913A/G （x2=7.963,P＝0.047）在HB-ACLF患者组的各年龄组间的差异有统计学意义。而在基因型C中,未发现任何位点变异率在患者组中各年龄组间的差异有统计学意义。8)多因素分析结果显示,与CHB-M患者相比,年龄（OR值为2.507,95%CI为1.607-3.910,P<0.001）、基因型（OR值为4.247,95%CI为2.572-7.014,P<0.001）以及A1762T/G1764A（OR值为2.370,95%CI为1.487-3.780,P<0.001）、A1846T（OR值为1.842,95%CI为1.185-2.863,P=0.007）和G1896A（OR值为1.617,95%CI为1.031-2.534,P=0.036）变异是HB-ACLF发生的危险因素。年龄大于或等于40岁、基因型B以及发生A1762T/G1764A、A1846T和G1896A变异的患者更易发生HB-ACLF。结论：1)HBV基因型B在HB-ACLF患者中显着高于其他两组患者,提示基因型B与HB-ACLF的发生相关。2) HBV BCP/PC/C区不同位点的变异存在基因型间的差异,因此比较这些位点变异在不同疾病组的发生率时需排除基因型带来的影响。3) HB-ACLF患者中A1762T/G1764A、A1846T和G1896A变异的发生率在基因型B和基因型C中均高于CHB-M患者,提示这四个位点变异可能与HB-ACLF的发生相关。4)多因素分析结果显示HBV基因型B、A1762T/G1764A双变异、A1846T和G1896A变异是HB-ACLF发生的独立相关因素,进一步支持上述结论。这些因素或可作为预测CHB预后的指标。第二章不同基因型、含不同突变位点的1.3拷贝乙型肝炎病毒重组质粒的构建目的：为进一步分析上述有意义位点变异株的生物学特点,分别构建了不同基因型、含有不同突变位点的1.3拷贝HBV重组质粒,为下一步体外实验提供必要的条件。方法：1)以提取的血清中的HBV DNA为模板,设计引物,三段法分别扩增HBV基因序列片段A （nt1063～1982）. B （nt2812～1084）和C （nt1063～2839）,分别插入pGEM-T Easy载体,构建亚克隆（质粒A、B和C）；利用QuikChange（?） XL Site-Directed Mutagenesis Kit对特定位点进行定点突变,获得突变的质粒,后分别经限制性内切酶双酶切后获得带粘性末端的A、B和C片段（质粒A先后经EcoT22I、EcoRI双酶切；质粒B先后经EcoT22I、EcoO65I双酶切；质粒C先后经HindⅢ、EcoO65I双酶切）,与经过EcoRI和HindⅢ双酶切的pUC19载体相连接、转化、筛克隆获得阳性重组质粒。2)利用限制性内切酶EcoRI和HindⅢ进行双酶切,对重组质粒进行初步鉴定；另外,采用直接测序法对插入片段DNA进行测序做进一步鉴定。结果：在3株病毒的基础上共构建8个pUC-HBV1.3拷贝重组质粒,2株B基因型（其中一株病毒有四个质粒,分别含有nt1762/1764和nt1896位点的野生型和／或突变型不同组合；另一株病毒有2个质粒,分别含有nt1846A或nt1846T）和1株C基因型（有两个质粒,分别含nt2159A或nt2159G）,经酶切和核苷酸序列测定结果均与预期相符,并且与相应的野生型质粒相比,无其他突变位点。结论：经体外突变重组,成功构建了不同基因型、含有不同变异位点的1.3拷贝HBV全基因组质粒。第三章不同基因型、含不同突变位点的1.3拷贝乙型肝炎病毒重组质粒体外转染细胞模型的相关生物学特征观察目的：分别比较突变株和相对应的野生株在体外细胞学水平上的生物学特性,试图初步观察它们是如何来影响CHB患者临床变化,从而为HB-ACLF的发病机理提供视角。方法：1)利用QIAGEN Hispeed midi kit中量质粒抽提试剂盒提取已构建好的质粒,以及pSEAP质粒。2)Huh7细胞复苏培养后,按1.5×106细胞/每孔接种至6孔细胞培养皿中,待细胞融合度为80～90%时,利用Lipofectamine2000转染试剂（5u1）,分别将质粒（2ug）和pSEAP报告基因质粒（0.1ug）共转染,并设置空白对照。3)利用SEAP试剂盒检测细胞上清中分泌性碱性磷酸酶（SEAP）的表达,以此平衡各组转染效率,并以相应的野生型质粒为对照换算相关结果。收集转染后72小时的细胞培养上清检测HBeAg水平。收集转染后72小时的细胞,抽提HBV复制中间体,Southern印迹杂交检测HBVDNA复制中间体。结果：1)细胞内HBV的复制活性：与相应的野生株相比,转染不同变异模式的重组质粒对细胞内HBV的复制无明显影响。2)细胞培养上清中HBeAg水平：以相应的野生株为对照,发生G1896A单独变异或联合A1762T/G1764A双变异后HBeAg表达缺失,而单独发生A1762T/G1764A双变异的,HBeAg水平下降至野生株的65%左右：引进A1846T变异后,HBeAg水平无明显改变；引进A2159G变异后,HBeAg水平较野生株上调17%左右。结论：1)转染不同变异模式的重组质粒对细胞内HBV复制活性的影响不明显。2) G1896A变异可导致HBeAg表达缺失；A1762T/G1764A变异仅部分下调HBeAg水平；A1846T变异对HBeAg水平影响不明显；A2159G变异对HBeAg水平有轻微上调作用。
刘盼[8]（2014）在《自然变异与干扰素诱导变异中HBV突变位点的规律及HBV突变与抗病毒药物关系研究》文中研究表明目的比较HBV-BCP区/前C/C区自然变异者与干扰素诱导变异者变异位点的规律，进而初步分析是否存在特定的干扰素诱导突变位点；探讨普通干扰素和拉米夫定在HBV-BCP区/前C/C区自然突变者中的短期抗病毒疗效；探讨普通干扰素诱导的HBV-BCP区/前C/C区突变者序贯应用聚乙二醇干扰素和拉米夫定序贯抗病毒治疗的短期疗效。方法采用回顾性队列研究，病例来自于郑州大学第一附属医院感染科门诊的104例检测出HBV-C基因区段（C基因启动子（BCP）/前C/C基因）突变的HBeAg阴性的慢性乙型肝炎（CHB-e）患者，据突变前有无干扰素治疗史分为自然变异组（A组，60例）和干扰素诱导变异组（B组，44例），通过分析两组突变位点的规律，进一步确定HBV-C基因区段是否存在干扰素诱导的特点突变位点；A组根据抗病毒药物的选择分为普通干扰素组（A1组，32例）和拉米夫定组（A2组，28例），检测两组抗病毒治疗6个月后的ALT、HBV-DNA水平；B组停用普通干扰素，根据其再次抗病毒药物的选择分为聚乙二醇干扰素组（B1组，共16例）和拉米夫定组（B2组，共28例），检测两组抗病毒治疗6个月后的ALT、HBV-DNA水平。结果1．60例HBV自然变异者（A组）与44例干扰素诱导变异者（B组）相比，前C区G1896A位点在两组的突变率分别为73.33%和68.18%，两组差异无统计学意义（P>0.05）；BCP区双位点（A1762T并G1764A）在两组的突变率分别为71.67%和65.90%，两组差异无统计学意义（P>0.05）；C基因区热点突变位点（I97L、S87G、L60V）的突变率在B组明显高于A组，差异有统计学意义（P<0.05）。2．A组60例自然变异者中32例（A1组）和28例（A2组）分别接受普通干扰素和拉米夫定抗病毒治疗6个月后，ALT复常率分别为90.63%和93.75%，两组差异无统计学意义（P>0.05）；HBV-DNA阴转率分别为96.43%和100%，且差异无统计学意义（P>0.05）。3．B组44例普通干扰素诱导变异者均停用普通干扰素干扰素，其中B1组（16例）和B2组（28例）分别接受聚乙二醇干扰素和拉米夫定序贯抗病毒治疗6个月后，两组ALT复常率分别为31.25%和75.00%，B2组明显高于B1组且差异有统计学意义（P＜0.05）；两组HBV-DNA阴转率分别为37.50%和82.14%，B2组明显高于B1组且差异有统计学意义。结论1．HBV-BCP区/前C/C区自然变异者与干扰素诱导变异者前C区G1896A位点及BCP区A1762T并G1764A双位点均有较高的突变率，但两组无明显差异，C基因区热点突变位点（I97L、S87G、L60V）在干扰素诱导突变组明显高于自然变异组，我们推测C基因区热点突变位点（I97L、S87G、L60V）可能是干扰素持续作用后的特定突变位点。2．HBV-BCP区/前C/C区自然变异者，干扰素和拉米夫定的近期应答率均较高且无明显差异。3．普通干扰素诱导HBV-BCP区/前C/C区变异者,应用拉米夫定序贯抗病毒治疗较聚乙二醇干扰素效果好。
李平[9]（2013）在《乙型肝炎病毒逆转录酶区A181T/V变异的相关研究》文中指出研究背景：乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染呈世界性分布,尽管乙肝疫苗已经普及了20年,但全球仍有20亿人感染过HBV,其中2.4亿为慢性感染。我国的慢性HBV感染者有9300万,其中2000万是慢性乙型肝炎患者。治疗慢性乙型肝炎最重要的手段是控制HBV复制,以减轻和延缓病情的发展。目前主要有两大类抗病毒药物：干扰素和核苷（酸）类似物。由于核苷（酸）类似物服用方便,作用效果强、不良反应少,已被越来越多的慢性乙型肝炎患者所接受。但在长期抗病毒治疗的同时,HBV会在药物的压力下获得适应性变异,产生耐药病毒株,导致治疗的失败。临床上轻则引起患者病情的进展,重则诱发肝硬化、肝衰竭等。因此耐药相关的研究已受到越来越多学者的关注。关于核苷（酸）类似物耐药的位点大多都集中在HBV逆转录酶（reverse transcriptase, RT）区的A至D结构域内。研究表明,目前能引起HBV耐药的5条通路中有2条通路都和B结构域rtA181T/V变异相关,这是一个交叉核苷和核苷酸两大类药物的交叉耐药位点,对目前几乎所有核苷（酸）类似物均呈现一定的耐药性。对rtA181T/V变异的研究有着深刻的意义。HBV基因组是短小而高效精干的,其中67%的基因组重叠编码,一段序列可重复编码1.5次。逆转录酶区的突变同样可以导致表面抗原S区编码氨基酸的改变。rtA181T变异后可引起S区氨基酸提前产生终止密码子,而使表面抗原截短；rtA181V变异后可引起表面抗原出现氨基酸的置换,那么这种对表面抗原的影响差异在临床上和实验室中是否一致?HBV在复制和传播中同时受到宿主免疫和药物压力的影响。除了核苷（酸）类似物的耐药主要发生在RT区,rtA181T/V变异病毒株的C区变异情况又如何呢?随着临床可选核苷（酸）类似物的增加,耐药变异的形式也呈现多样化、复杂化。不同的多药耐药位点出现是临床所面临的新挑战,有很多针对这方面的研究,但大多是对直接测序的结果而展开。这样并不能分清不同的变异位点在同一株病毒上,还是不同的病毒株之间,因此有必要对其采用克隆后测序的方法,对宿主体内病毒准种进行详尽的分析,了解病毒的变异特点。基因型可能影响病情发展和预后。我国慢性乙型肝炎患者主要是B基因型和C基因型,rtA181T/V变异在这两种不同基因型间是否存在选择,不同基因型的rtA181T/V变异表现是否一致?因此,有待对上述诸多问题进行详尽的分析,为临床抗病毒治疗提供理论基础。第一章乙型肝炎病毒逆转录酶区181位点变异的临床特征分析目的：探讨rtA181变异和临床抗病毒用药的关系,变异后患者临床特征的变化,rtA181变异的模式,与我国B、C基因型的关系,以及A181位点不同变异之间的差异。方法：1、筛选经核苷（酸）类似物治疗产生rtA181变异的慢性乙型性肝炎患者,纳入研究的85例患者符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》诊断。对所有患者抗病毒治疗期间的相关临床资料进行回顾,并对发生耐药时的患者肝功能、表面抗原、e抗原、HBV DNA等指标进行检测,通过PCR产物测序结果确定基因型。2、所有数据均使用SPSS13.0统计软件进行分析。患者资料中计数资料构成比采用R×C表的χ2检验,定量资料采用用独立样本t检验。以P值小于0.05时有统计学差异。结果：1、RT区A181位点变异的主要模式有8种：A181T、A181V、A181T+N236T、 A181V+N236T、A181T+A181V、A181T+M204I/V±L180M±V173L、 A181V+M204I/V±L180M±V173L、A181T+N236T+M204I等。84例（98.82%）患者接受过阿德福韦治疗。rtA181TAV变异在阿德福韦治疗组中有9例,而在拉米夫定换用阿德福韦治疗组中有33例,其分布存在统计学显着差异（P=0.046）；rtA181T/V+rtN236T变异模式在两组中分别为16例和11例,两者比较亦存在显着差异（P<0.001）；而rtA181T/V+rtM204I/V变异在两不同治疗组中分布同样存在差异（P=0.016）。2、与抗病毒治疗前相比,尽管发生rtA181耐药变异,患者临床相关指标仍可能有所改善。反映肝功能的ALT由抗病毒治疗前的175±130U/L下降至82-49U/L（P<0.001）；反映病毒复制状态的HBV DNA由5.97±1.26log10copies/mL下降至4.10±1.18log10copies/mL （P<0.001）;病毒的表面抗原（HBsAg）由3.66±0.36log10COI下降到3.50±0.45log10COI （P=0.013）。但是患者HBeAg状态在治疗前后变化不大（P=0.973）。3、85患者中,13例（15.7%）为B基因型,72例（84.3%）为C基因型,未见其他基因型。B基因型患者中rtA181T变异4例,rtA181V变异9例；C基因型中rtA181T变异40例,rtA181V变异30例,rtA181T+rtA181V变异2例。不同变异在基因型分组中统计学无差异（P>0.05）。4、按照B、C基因型分组,两组患者在抗病毒治疗前临床资料相近,未见统计学差异（P>0.05）。在出现耐药时的相关临床特征（ALT、HBsAg、HBV DNA、 HBeAg等）亦没有表现出明显统计学差异（P>0.05）。5、按照rtA181T和rtA181V不同变异分组,患者在抗病毒治疗前的一般资料、生化指标、病毒水平、表面抗原水平、e抗原状态等方面比较无差异（P>0.05）,但在出现变异耐药时,rtA181T突变组的HBsAg水平较rtA181V组低（3.40±0.351gCOI vs.3.62±0.541g COI, P=0.030）。与抗病毒前相比,rtA181T变异患者出现耐药时的生化、病毒指标明显下降（P<0.05）；而rtA181V变异患者耐药时病毒量和转氨酶明显改善（P<0.001）,但HBsAg水平似乎变化不明显（P=0.315）。结论：1、rtA181变异主要和阿德福韦用药有关。rtA181T/V变异在拉米夫定换用（或加用）阿德福韦的治疗患者中多见；而A181T/V+N236T变异多出现在单用阿德福韦治疗的患者中。2、rtA181T/V变异后病情可能不出现大的反弹。3、B、C基因型对rtA181变异无明显影响。不同变异模式在B、C基因型中的分布无差异；不同基因型患者变异后的临床指标也相近。4、rtA181T变异和rtA181V变异患者在抗病毒治疗前的临床资料统计无差异。但在发生变异时,rtA181T变异组的HBsAg水平较rtA181V组的低。第二章乙型肝炎病毒逆转录酶区181位点变异的病毒学特点分析目的：探讨HBV rtA181变异病毒的准种特点,以及不同变异中前C区G1896A及BCP区A1762T/G1764A变异的情况。方法：1、选部分标本对HBV逆转录酶区进行扩增,纯化回收后插入pMD18T载体,转化DH5α大肠杆菌。对每个样本挑选18个以上的克隆进行测序,经Vector NTI软件进行组装拼接,并用Chromatogram软件比对测序峰图,MEGA4、 BioEdit软件比对序列,分析病毒准种特点。2、对所有标本PCR扩增C基因区nt1623～nt2076,产物直接测序后分析BCP、pC变异与rtA181变异的关系。3、前C区和基本核心启动子变异分析采用计数资料的χ2检验。P值小于0.05时有统计学差异,所有统计学分析使用SPSS13.0软件进行。结果：1、检测到位于同一病毒株上的rtA181相关耐药组合有：A181T+M204V、 A181T+N236T、A181V+N236T,A181T+V173L、L180M+181V和A181T+N236T+M250L,尚未发现L180M+181T组合耐药变异株。2、rtA181T变异株在其病毒准种中所占比例为14.3%～95.2%;rtA181V变异株在病毒准种的比例为60.0%-100.0%。全部为rtA181V变异病毒准群的基因组距离和熵值相对较低。克隆分析还发现PCR直接测序不能检测到的rtA181D和rtA181L变异。3、C基因核心启动子A1762T和G1764A双突变在rtA181T变异组的比例明显较rtA181V变异组高（P=0.009）,而前C区G1896A位点突变在rtA181变异组合CHB对照组间并没有表现出显着差异（P=0.144）。结论：1、鉴定出多种同一病毒株上的rtA181T/V伴随的组合耐药变异形式。2、rtA181T变异病毒准种中常混有野生型病毒株。rtA181变异除了常见的rtA181T和rtA181V变异外,还可有rtA181D和rtA181L等变异。3、BCP突变在rtA181T变异组中出现比例高于rtA181V变异组,高于慢乙肝对照组。第三章不同基因型1.24拷贝乙型肝炎病毒rtA181T/V突变株的构建目的：为进一步比较rtA181变异在不同基因型之间的生物学特点,构建rtA181T和rtA181V突变质粒,为下一步体外实验提供必要的条件。方法：1、利用Mizokami教授惠赠的Ae-JPN、Ba-JPN58、C-JPNAT、D-US68四株1.24拷贝HBV不同基因型的重组质粒为模板,设计错配碱基引物,通过重叠延伸PCR的方法,获得人工定点突变RT区相应片段,利用XbalⅠ和SphⅠ两个单酶切位点,与野生病毒株相应序列置换,获得不同基因型rtA181T突变和rtA181V突变病毒株。2、采用引物M13F和M13R对构建突变质粒进行PCR扩增鉴定；利用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,以及EcoRⅠ单酶切对重组质粒进行酶切鉴定,初步鉴定重组突变质粒。对各基因型分别取3株rt181T突变株和rt181V突变株克隆,对插入片段DNA进行测序,确认突变质粒的正确构建。结果：构建不同基因型的rtA181T突变和rtA181V突变的pUC-HBV1.24质粒,经PCR扩增、酶切和核苷酸序列测定结果均与预期相符；pUC-HBV1.24-181T质粒的FLLA基序氨基酸突变为FLLT,而pUC-HBV1.24-181V质粒的相应氨基酸突变为FLLV,并且与野生型质粒相比,未引入其他突变位点。结论：经体外突变重组,成功构建了不同基因型rtA181T/V突变的1.24拷贝的HBV全基因突变株。第四章不同基因型乙型肝炎病毒逆转录酶区181位点变异株体外特性研究目的：比较A、B、C、D四种基因型的rtA181T和rtA181V耐药变异病毒在体外细胞学水平上的生物学特性,为临床抗病毒及挽救治疗提供理论依据。方法：1、利用OMEGA公司的Endo-Free中量质粒抽提试剂盒提取Ae-JPN、 Ba-JPN58、C-JPNAT、D-US68四种野生型和rtA181T/V突变病毒质粒,以及pSEAP质粒。2、HepG2细胞复苏培养后,按1.5×106细胞/每孔接种至6孔细胞培养皿中,待细胞融合度80～85%时,利用X-tremeGENE HP DNA转染试剂按1：3的比例,分别将pUC-HBV1.24-181T或pUC-HBV1.24-181V质粒（5ug）和pSEAP报告基因质粒（0.1ug）共转染,并设置空转对照。转染48～72小时后收集细胞上清进行HBsAg和HBV DNA的检测。2、模拟宿主体内混合病毒株状态,将不同基因型的rtA181T突变质粒与其野生型质粒分别按0：1、1：0、1：1、1：9四种不同比例混合（转染质粒总量为5ug）,与0.1ug pSEAP质粒共转染HepG2细胞。转染48～72小时后测定细胞上清中HBsAg和HBV DNA水平。4、利用SEAP试剂盒检测细胞上清中分泌性碱性磷酸酶（SEAP）的表达,以此平衡各组转染效率,并以各基因型的野生型质粒为对照换算相关结果。5、同一基因型之间统计采用独立样本t检验。若方差不齐,采用Satterthwaite近似t检验。不同基因型之间统计采用单向方差分析（One-Way ANOVA）。HBV DNA在进行统计前先进行对数转换。结果：1、rtA181T突变后明显影响HBsAg的分泌,细胞培养上清中的HBsAg几乎检测不出,只有各野生型0.33%～2.22%；而rtA181V突变后影响相对较小,HBsAg水平能维持在野生型的80%以上。各基因型中rtA181T突变和rtA181V突变之间HBsAg比较均存在显着差异（P<0.001）。2、rtA181T突变明显影响HBV颗粒的合成,大部分细胞上清中检测不到HBV颗粒,即使检测到也是较低,在102拷贝/mL水平。各基因型的rtA181T突变和rtA181V突变之间病毒颗粒的分泌均存在明显差异。3、不同基因型rtA181T突变质粒的HBsAg水平比较无统计学差异（F=1.563,P=0.272）；而不同基因型rtA181V突变质粒的HBsAg水平存在差异（F=6.261, P=0.017）, A, D基因型的HBsAg水平比B基因型的水平高。4、rtA181V突变质粒的HBV DNA水平在不同基因型间存在差异（F=25.630,P<0.01）,具体表现为B、C基因型的DNA水平较A和D基因型的低。5、rtA181T突变株与野生型质粒共转染后,HbsAg表达缺陷能够得到部分纠正。当野生型质粒比例占10%时,细胞培养上清液中能检测到少量HBsAg;当野生型质粒比例提高到50%左右,HBsAg水平能恢复高到50%左右。组间进行比较发现：在野生质粒50%的情况下,不同基因型的HBsAg水平存在差异（F=4.799,P=0.034）。A基因型的相对活性较高、而D基因型的活性相对较低。在野生质粒10%和0的情况下,不同基因型之间HBsAg水平无明显差异（P>0.05）。6、rtA181T突变株和野生株共转染后,细胞上清中的HBV DNA表达情况也和HBsAg近似。随着野生型质粒浓度的提高,病毒表达情况也逐渐提高,野生型质粒50%的时候,HBV DNA水平已达到40%以上。但在不同比例的混合质粒中,不同基因型之间比较均没有统计学差异（P>0.05）。结论：1、不同基因型的：rtA181T突变对病毒表面抗原释放、病毒颗粒合成都有较大的影响,但在各基因型之间比较没有明显差异。rtA181V突变对病毒的生物学特征影响较小,但在不同基因型之间存在差异。2、各基因型的野生株均能够挽救rtA181T突变株的生物学缺陷,不同基因型的挽救效果略有差别。
徐航娣[10]（2013）在《与慢加急性肝衰竭（ACLF）相关的乙型肝炎病毒（HBV）突变位点的研究》文中进行了进一步梳理乙型病毒性肝炎仍是一个世界性的公共卫生问题,全球范围内乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）的慢性感染人群高达3.5亿以上。HBV相关的慢加急性肝衰竭（acute on chronic liver failure, ACLF）是慢性肝炎患者死亡的重要原因,如果不进行肝移植,其死亡率高达60-80%,每年大约有22600的患者死于肝衰竭。长期以来宿主免疫一直被认为是乙型肝炎加剧的主要原因,但是近年的研究结果表明病毒因素在ACLF的发病中同样起重要作用。HBV是嗜肝病毒家族的一员,其DNA全长约为3200个核苷酸,呈现部分双链环状。HBV基因组包含4个相互重叠的开放性读码框,分别编码HBV表面抗原、核心抗原、聚合酶和多功能的非结构性蛋白X。由于HBV的复制过程包含前基因组RNA的逆转录,其逆转录酶缺乏校正功能,故HBV的突变率显着高于其它的DNA病毒。HBV基因组的突变率可随着病毒的复制不断增加,其中一些突变可能与慢性肝炎的急性加剧相关,可作为ACLF的预警的生物标志物和抗病毒治疗的靶标。近来有研究表明基本核心启动子区的A1762T/G1764A突变与ACLF发病相关,A1846T、G1896A和C1913A/G位点的突变在ACLF患者中发生率显着高于慢性肝炎患者。目前关于HBV突变和ACLF发病的关系主要集中于基本核心启动子区和前核心区,对HBV基因其它部位的研究尚少。ACLF是否有另外的一些HBV突变位点与ACLF发病有关尚不清楚,为此本研究用HBV全基因组测序筛选出与ACLF发病相关的HBV突变,并发现一些新的突变位点,经过扩大样本的验证,以期为ACLF的预警提供依据。方法1HBV全基因测序筛选与ACLF发病可能相关的HBV突变位点1.1Illumina高通量测序。样本来自两组（12例ACLF和12例慢性轻度乙型肝炎（mildchronic hepatitis B, CHB-M））年龄配对、性别和基因型分布无显着差异患者,所有样本HBV的DNA水平均>100,000copies/mL。首先从200μl的血清中提取病毒DNA,分3段重叠扩增HBV全基因组。PCR产物在Genome Analyzer II平台上进行高通量测序,然后处理高通量测序数据。1.2检测上述样本的肝功能指标（ALT, AST, TBIL, PTA）, HBV血清标记物和HBV DNA滴度。1.3分析GenBank数据库的HBV基因突变情况：在GenBank数据库中搜索中国地区报道的ACLF和CHB-M相关的HBV全基因序列共258条（ACLF患者序列143条,CHB-M患者序列115条）,分析其突变。2HBV突变与ACLF发病的关系的验证2.1样本。来自80例无症状携带者（asymptomatic carriers, ASC）、152例CHB-M、102例慢性重度乙型肝炎患者（severe chronic hepatitis B, CHB-S）和104例ACLF患者,共438例。2.2从200μ1血清中提取HBV DNA,半巢式PCR扩增HBV基因组目标序列,PCR产物行常规Sanger测序。2.3检测上述样本肝功能指标,HBV血清标记物和HBV DNA商度。结果1Illumina高通量测序筛选结果1.1作为质量控制的质粒测序结果显示：所测得的读长36bpDNA序列的不同位置发生测序错误的频率不一致,在20位碱基之后其碱基替换率呈现上升趋势,当位于序列的第30-36个碱基时,测序的错误率显着上升。为了降低错配率,我们截取每个短片段序列前面的20bp进行质粒全长的拼接。质粒序列的总体误差率为0.49%,其中每一百个核苷酸中错配碱基读取频率>4%的核苷酸平均为2.4个,将4%作为区分真实突变和技术误差的界线。1.2T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、G2095A、A2159G、A2189C和G2345A为ACLF患者常见的突变位点,在12例ACLF患者中发生上述突变的病例数分别为10例、9例、10例、10例、8例、5例、10例、11例和7例。1.3T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、G2095A、A2159G、A2189C和G2345A这9个位点的突变频率在ACLF患者中显着高于慢性轻度肝炎患者（P<0.05或P<0.01）。1.4基本核心启动子区（basal core promoter, BCP）（A1762T/G1764A）突变在12例ACLF和12例CHB-M患者中的发生率均为6例。其突变频率在ACLF患者和慢性轻度肝炎患者未见显着差异。1.5从Genbank数据库下载258条HBV全基因序列,分析上述突变的分布情况发现：T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、A2159G、A2189C和G1764A在ACLF中的发生率均显着高于CHB-M, G2095A、G2345A和A1762T在ACLF组和CHB-M组间未见差异。分别对HBV B基因型和C基因型患者的突变进行分析发现,在B基因型的患者中,T216C、G285A、A1846T、G1896A和C1913A/G这5个位点突变在ACLF组中显着高于CHB-M组；C基因型患者中,A1846T、C1913A/G、A2159G、A2189C和G1764A这5个突变在ACLF组中显着高于CHB-M组。A1762T/G1764A双联突变在B基因型和C基因型的ACLF患者中均未见显着升高。2HBV点突变与ACLF发病的关系的验证结果2.1ACLF组的B基因型比率显着高于其余三组慢性乙型肝炎患者。2.2T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、C1913A/G、A2159G/C和A2189T/C这7个突变的发生率在ACLF组显着高于ASC、CHB-M和CHB-S组（P<0.05或P<0.01）。2.3T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、C1913A/G这5个位点在HBV基因型B的感染者中显着高于HBV基因型C感染者。2.4对ASC、CHB-M、CHB-S和ACLF患者的B基因型和C基因型毒株的突变进行比较发现：以ASCs为对照组,B基因型毒株感染者中,T216C、G285A、G1896A、 C1913A/G突变在CHB-S和ACLF组中均显着升高；C基因型毒株感染者中,A1846T/G、G1896A、C1913A/G、A2159G/C突变在ACLF组和CHB-S组中显着升高。以CHB-M为对照组,HBV B基因型毒株感染者中,T216C、G285A、G1896A、 C1913A/G和A2159G/C在ACLF患者中显着升高；C基因型毒株感染者中,G285A、A1846T/G、G1896A和C1913A/G在ACLF患者中显着升高。当以CHB-S为对照时,基因型B毒株感染者中,A2159G/C和A2189T/C在ACLF组中显着升高。2.5与非ACLF组比较,B基因型毒株的T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、 C1913A/G、A2159G/C和A2189T/C与ACLF密切相关,而C基因型毒株的G285A、 A1846T/G、G1896A、C1913A/G和A2159G/C与ACLF密切相关。2.6多因素分析显示T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C是ACLF发病的独立危险因素。2.7T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C的两个或以上的联合突变与ACLF发生密切相关。2.8“含C216的联合突变”,“含A/G1913的联合突变”,“含G/C2159的联合突变”对ACLF诊断具有较高的特异性。结论1B基因型病毒感染的慢性乙型肝炎患者更容易发展为ACLF。2T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C突变为ACLF发生的独立危险因素。其中T216C和A2159G/C系本研究新发现的ACLF发病的独立危险因素（T216C位点已申请国际专利,国际申请号PCT/CN2012/071108）,提示了HBV S区和核心区突变在ACLF发病过程中可能起着重要作用。3HBV联合突变的分析发现,联合突变在ACLF发病中发挥更为重要的作用。“含C216的联合突变”,“含A/G1913的联合突变”,“含G/C2159的联合突变”对ACLF的诊断特异性较高。4上述病毒突变可作为预测乙型肝炎加剧的分子标志物,为阻止ACLF发病和改善HBV感染者的预后提供依据。
二、乙型肝炎病毒C区G87变异对HBeAg分泌的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙型肝炎病毒C区G87变异对HBeAg分泌的影响（论文提纲范文）
（1）青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 青藏高原藏族人群HBV基因序列分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.引物及扩增条件 |
| 3.主要试剂、耗材及生产厂家 |
| 4.主要仪器设备及生产厂家 |
| 5.HBV生物信息学分析主要软件 |
| 6.实验方法 |
| 7.HBV荧光定量PCR检测 |
| 8.生物信息学分析方法 |
| 9.统计分析 |
| 10.质量控制 |
| 二、结果 |
| 1.青藏高原藏族人群血清HBV全序列扩增结果 |
| 2.HBV DNA全长序列分型分析 |
| 3.青藏地区HBV/CD重组体不同区段系统发育分析结果 |
| 4.青藏高原藏族人群全长序列基本信息及地理分布 |
| 5.HBV/CD重组体全序列基因变异分析结果 |
| 6.HBV血清型分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 HBV/CD重组型表面抗原抗体双阳性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.DNA序列拼接与分析 |
| 3.HBV荧光定量PCR检测 |
| 4.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBsAg和HBsAb双阳性的发生率 |
| 2.双阳性组和对照组的基本信息 |
| 3.PreS/S区氨基酸突变率分析结果 |
| 4.全序列核苷酸和氨基酸突变位点分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 HBV/CD重组体时空动力学分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建 |
| 2.数据库内序列的基因型和重组分析 |
| 3.用于时空动态分析的主要工具和软件 |
| 4.时空动态分析方法 |
| 5.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建情况 |
| 2.HBV D基因片段tMRCA分析结果 |
| 3.HBVC基因片段tMRCA分析结果 |
| 4.HBV/CD1重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 5.HBV/CD2重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 6.HBVC基因型和D基因型时空动态分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 乙肝病毒感染者血清表面抗原表面HBsAg/HBsAb双阳性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（2）HBV基因ntA1762T/G1764A及S蛋白I126T联合变异的临床与实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 慢性HBV感染患者HBV基因慢性HBV感染者S/BCP编码区基因突变位点分析 |
| 实验对象 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第二部分 HBV ntA1762T/G1764A与I126T联合变异重组质粒的构建及体外实验 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获奖及发表文章情况 |
| 致谢 |
（3）HBV-DNA突变和细胞因子与HBV相关肝硬化和肝癌的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 HBV-DNABCP区/前C区突变和肝硬化/肝癌的相关性研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 血清细胞因子和HBV相关肝硬化/肝癌的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 CCL5及其受体在肝细胞肝癌中的功能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词一览表 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）乙型肝炎病毒核心蛋白区变异与隐匿性乙型肝炎病毒感染的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 重叠延伸PCR和定点突变PCR技术构建乙型肝炎病毒核心蛋白区突变型质粒 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 实验讨论 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒核心蛋白区突变型质粒在HuH7细胞和Balb/c小鼠中的表达情况 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）中药联合阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎的疗效预测分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一: 慢性乙型肝炎中医学认识及研究进展 |
| 1 慢性乙型肝炎的中医病名渊源 |
| 2 中医对慢性乙型肝炎病因病机演变的认识 |
| 3 慢性乙型肝炎中医证候特点 |
| 4 中医药治疗慢性乙型肝炎进展 |
| 5 中西医结合治疗慢性乙型肝炎的现状 |
| 6 导师学术思想 |
| 7 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二: 西医对慢性乙型肝炎疗效预测的研究进展 |
| 1 乙型肝炎病毒与慢性乙型肝炎 |
| 2 慢性乙型肝炎的西医治疗进展 |
| 3 慢性乙型肝炎的疗效预测进展 |
| 4 优化治疗策略探讨 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 临床研究 |
| 资料 |
| 1 研究对象 |
| 2 纳入与排除标准 |
| 3 诊断标准 |
| 4 研究用药 |
| 5 给药方案 |
| 方法 |
| 结果 |
| 1 基线指标水平对48周结局预测作用 |
| 2 治疗12周指标变化对48周结局预测作用 |
| 3 治疗24周指标变化对48周结局预测作用 |
| 4 试验组、对照组和HBeAg转阴、未转阴人群各时点特点分析 |
| 5 影响48周疗效的多因素Logistic回归分析 |
| 6 疗效影响因素预测价值的ROC曲线评价 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 1 各项指标对48周结局的预测作用 |
| 2 试验组、对照组和HBeAg转阴、未转阴人群各时点特点分析 |
| 3 影响48周疗效的多因素分析 |
| 4 48周疗效影响因素预测价值的评价 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）海洋天然活性小分子物质抗乙肝病毒效果筛选研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 HepG2.2.15细胞株培养体系的建立 |
| 第一节 细胞培养 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第二节 上清液中HbsAg和HbeAg分泌曲线的绘制 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 本研究所用海洋天然活性小分子物质的来源 |
| 1. 海洋共生菌株Halobacillus sp.中的小分子化合物(27种) |
| 2. 网状软柳珊瑚中小分子化合物(8种) |
| 3. 海洋共生菌株Bacillus subtili中小分子化合物(7种) |
| 第三章 海洋天然小分子物质对细胞的毒性试验 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 海洋生物小分子化合物对HepG2.2.15细胞株HBsAg和HBeAg的抑制效果评价 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第五章 海洋小分子化合物抑制HepG2.2.15细胞株分泌HBV DNA效果的评价 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 小结 |
| 本研究创新性 |
| 本研究的不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 主要英汉缩略对照表 |
| 实验选取的20种小分子化合物 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文情况 |
（7）乙型肝炎病毒基因型及基因变异与慢加急性肝衰竭间的关系及其可能的致病机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 研究背景 |
| 1. 肝衰竭的相关概念 |
| 2. 乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭可能的发病机理 |
| 3. HBV基因型与乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭 |
| 4. HBV基因变异与乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭 |
| 5. 研究目的及意义 |
| 第一章 乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭患者的血清中病毒学特征分析 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 研究结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 不同基因型、含不同突变位点的1.3拷贝乙型肝炎病毒重组质粒的构建 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 研究结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 不同基因型、含不同突变位点的1.3拷贝乙型肝炎病毒重组质粒体外转染细胞模型的相关生物学特征观察 |
| 3.1. 材料和方法 |
| 3.2 研究结果 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
| 统计合格证明 |
（8）自然变异与干扰素诱导变异中HBV突变位点的规律及HBV突变与抗病毒药物关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 1 引言 |
| 2 研究对象与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 分组 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 检测指标 |
| 2.5 疗效判定标准 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 HBV各突变位点在自然变异组与干扰素诱导变异组的规律 |
| 3.2 自然变异者应用干扰素和拉米夫定抗病毒疗效比较 |
| 3.3 普通干扰素诱导变异者应用聚乙二醇干扰素（B1组）和拉米夫定（B2组）疗效比较 |
| 4 结论 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 HBV 前 C/BCP 区基因变异的研究 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）乙型肝炎病毒逆转录酶区A181T/V变异的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 研究背景 |
| 1. HBV流行情况和治疗情况 |
| 2. HBV的分子生物学 |
| 3. HBV耐药的发生机制 |
| 4. 耐药相关概念 |
| 5. rtA181变异的概念 |
| 6. rtA181变异的产生 |
| 7. rtA181变异的临床特点 |
| 8. rtA181变异的临床策略 |
| 9. 总结与展望 |
| 第一章 乙型肝炎病毒逆转录酶区181位点变异的临床特征分析 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 乙型肝炎病毒逆转录酶区181位点变异的病毒学特点分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 不同基因型1.24拷贝乙型肝炎病毒rtA181T/V突变株的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 不同基因型乙型肝炎病毒逆转录酶区181位点变异株体外特性研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要成果 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（10）与慢加急性肝衰竭（ACLF）相关的乙型肝炎病毒（HBV）突变位点的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 目次 |
| 引言 |
| 1 HBV分子生物学特征 |
| 2 HBV基因型/基因变异与ACLF的关系 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第一部分 HBV全基因测序筛选与ACLF发病可能相关的HBV突变位点 |
| 1 材料和方法 |
| 2 研究结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 在438例慢性乙型肝炎患者中验证HBV突变与ACLF发病的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 2 研究结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
四、乙型肝炎病毒C区G87变异对HBeAg分泌的影响（论文参考文献）
- [1]青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究[D]. 刘贺. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [2]HBV基因ntA1762T/G1764A及S蛋白I126T联合变异的临床与实验研究[D]. 戴海梅. 昆明医科大学, 2019(06)
- [3]HBV-DNA突变和细胞因子与HBV相关肝硬化和肝癌的相关性研究[D]. 陈伟. 南方医科大学, 2017(11)
- [4]乙型肝炎病毒核心蛋白区变异与隐匿性乙型肝炎病毒感染的相关性研究[D]. 陈静娜. 南方医科大学, 2017(01)
- [5]中药联合阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎的疗效预测分析[D]. 舒格拉·哈比丁. 北京中医药大学, 2016(04)
- [6]海洋天然活性小分子物质抗乙肝病毒效果筛选研究[D]. 吴书志. 广西医科大学, 2015(08)
- [7]乙型肝炎病毒基因型及基因变异与慢加急性肝衰竭间的关系及其可能的致病机制[D]. 杨贵奉. 南方医科大学, 2014(01)
- [8]自然变异与干扰素诱导变异中HBV突变位点的规律及HBV突变与抗病毒药物关系研究[D]. 刘盼. 郑州大学, 2014(03)
- [9]乙型肝炎病毒逆转录酶区A181T/V变异的相关研究[D]. 李平. 南方医科大学, 2013(03)
- [10]与慢加急性肝衰竭（ACLF）相关的乙型肝炎病毒（HBV）突变位点的研究[D]. 徐航娣. 浙江大学, 2013(03)