一、HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验研究（论文文献综述）
杨佳奇,李红[1]（2020）在《入胞抑制剂Myrcludex-B合成肽对HBV感染HepaRG细胞体外感染模型的抑制作用研究》文中研究指明目的建立乙型肝炎病毒（HBV）阳性血清体外感染人肝癌细胞（HepaRG）的实验模型,并探索入胞抑制剂Myrcludex-B在体外感染模型中对HBV的抑制作用。方法将诱导成熟的HepaRG细胞分成加聚乙二醇（PEG）的感染组和无PEG的感染组,再将两种感染组分别分为添加Myrcludex-B肽段的处理组和不添加Myrcludex-B肽段的对照组,用HBV DNA阳性患者的血清对细胞进行感染。取细胞上清液,用荧光定量PCR检测上清液中HBV DNA的表达量,用化学荧光法检测细胞上清液中HBsAg、HBeAg的含量。两组间计量资料不服从正态分布的采用秩和检验,服从正态分布的采用t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。结果在处理组中,加PEG感染组和不加PEG感染组的病毒滴度分别为（103 877.00±49 013.24）拷贝/ml、（5 050.09±631.26）拷贝/ml;在对照组中,加PEG感染组和不加PEG感染组的病毒滴度分别为（116 188.57±50 957.19）拷贝/ml、（5 119.34±1 102.43）拷贝/ml,两组中加PEG感染组的病毒滴度显着高于不加PEG感染组（P < 0.05）,差异有统计学意义。在加PEG的感染组中,加肽段处理组和无肽段对照组的病毒滴度分别为（103 877.34±49 013.24）拷贝/ml、（116 188.57±50 957.19）拷贝/ml,加肽段处理组病毒滴度明显下降（P < 0.05）,差异有统计学意义;该组0、1、2、3 d上清液中HBsAg的含量均为阳性,且0 d上清液中加肽段处理组的HBsAg较无肽段对照组呈明显下降趋势。结论用添加PEG的HBV DNA阳性血清体外感染HepaRG细胞的实验模型是可行的,且在该试验模型中,入胞抑制剂Myrcludex-B对HBV感染存在一定的抑制作用。
刘殿星[2]（2019）在《HBV相关肝癌外泌体通过激活CMA途径诱导肝癌细胞化疗抵抗的机制研究》文中认为目的原发性肝癌（Primary liver cancer,PLC）是我国常见的恶性肿瘤之一,目前肝癌患者化疗抵抗现象十分严重。本研究将初步明确肝癌患者对奥沙利铂（Oxaliplatin,Oxa）治疗敏感性降低和乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染相关,并证实HBV相关肝癌细胞分泌的外泌体通过激活分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy,CMA）途径诱导肝癌细胞凋亡抵抗的分子学机制,从而为提高肝癌患者的化疗敏感性的研究提供相关理论基础。方法1收集华北理工大学附属医院HBV相关原发性肝癌患者（HbsAg阳性、HBV DNA复制的肝癌患者）及非HBV相关原发性肝癌患者（HBV、HCV均阴性的肝癌患者）经奥沙利铂（TACE:130mg/m2）治疗前后的资料,进行统计学分析,比较两组患者治疗后肿瘤体积的变化情况;2体外培养肝癌细胞HepG2细胞;收集我院HBV阳性患者的血清（HBV DNA复制量>1.0×109拷贝/ml）和健康体检者血清（HBV、HCV均阴性）分别作用HepG2细胞48h,弃去上清液后,磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）清洗8-10遍,加入纯DMEM培养基继续培养,分别取0h、12h、24h、48h、72h和96h等不同时间段细胞上清液,实时荧光定量PCR仪检测上述上清液中HBV DNA含量;留取上述血清作用后的细胞上清液,采用外泌体提取试剂盒提取细胞上清液中的外泌体,利用Western Blot、透射电镜和Nanosight纳米颗粒跟踪分析仪对外泌体进行鉴定;3将上述提取外泌体分别作用肝癌细胞12h后,奥沙利铂继续作用细胞24h,收集细胞,提取蛋白,利用Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3和Bcl-2的表达情况;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;同时采用Western Blot检测CMA途径关键分子Lamp2a的表达情况;4 shRNA干扰技术沉默HepG2细胞内Lamp2a基因,外泌体作用sh-Lamp2a HepG2细胞12h后,加入Oxa继续作用细胞24h,流式细胞术检测细胞凋亡水平;5采用SPSS17.0软件进行统计学分析,采用t检验或者单因素方差分析进行组间比较。结果1通过收集肝癌患者资料,选取Child-Pugh分级和BCLC分期相同的两组肝癌患者,统计学分析两组患者分别在性别、年龄方面无明显差异。统计分析非HBV相关肝癌患者和HBV相关肝癌患者经Oxa（TACE:130mg/m2）治疗3个月后肿瘤体积的减小程度分别为（61.45±14.35）%和（36.81±15.27）%,P<0.05,差异有统计学意义;2 HBV感染HepG2细胞后,实时荧光定量PCR分析上清液HBV DNA含量在96h达到1.5×104 copies/ml,收集该时间段上清液提取外泌体;透射电镜观察外泌体大量分布且形态为椭圆形囊泡,同时Western Blot测得外泌体中CD63、CD9明显表达,利用Nanosight纳米颗粒跟踪分析仪检测HepG2细胞分泌外泌体粒径为150nm左右,同时测得HBV相关肝癌组和非HBV相关肝癌组外泌体浓度分别为（5.25±0.63）×10100 particle/ml和（4.95±0.87）×10100 particle/ml,两组外泌体浓度分布无统计学意义。3 HBV相关肝癌外泌体作用肝癌细胞,通过Western Blot检测显示凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3表达下调而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显上调;流式细胞术检测HBV相关肝癌外泌体作用肝癌细胞后的细胞凋亡率为（45.21±7.69）%,较对照组（54.21±7.69）%明显减低;同时Western Blot表明CMA途径关键分子Lamp2a的表达较对照组明显上调。4成功干扰细胞内Lamp2a基因,HBV相关肝癌外泌体联合Oxa作用sh-Lamp2a HepG2细胞后,流式细胞仪检测细胞凋亡率（71.34±12.98）%较对照组（56.16±11.62）%明显上调。结论1 HBV相关肝癌细胞通过外泌体介导肝癌细胞对奥沙利铂的化疗抵抗;2HBV相关肝癌外泌体通过激活CMA途径下调肝癌细胞对奥沙利铂的化疗敏感性。图7幅;表1个;参41篇。
高颖[3]（2017）在《血清HBV中和抗体水平检测方法的建立及初步应用》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus,HBV）感染是中国乃至全球重要的公共卫生问题。全球近2.4亿人为慢性乙肝病毒携带者,每年约65万人死于肝硬化、肝癌等HBV感染相关疾病（WHO）。现有的抗病毒治疗尚不能根治乙肝,接种预防性乙肝疫苗是预防-HBV感染,降低人群HBsAg（HepatitisB Surface Antigen）携带率最为有效的手段。注射疫苗后的个体会产生不同的抗体水平,不同的抗体中和活性将决定宿主对于HBV的保护性。有研究显示,约有10-15%的人群在接种疫苗后无应答或低应答,可能需要加大接种剂量。目前主要评价中和抗体活性的方法主要是基于“结合活性”的免疫化学分析法,如酶联免疫吸附试验（ELISA）等,并不能真实反映血清中Anti-HBs抗体的中和活性。本研究拟基于HBV体外感染细胞模型建立一个血清HBV中和抗体水平检测方法。前期本实验室构建的过表达钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP）的肝癌细胞HepG2-NTCP,可作为乙肝病毒感染的细胞模型,实现HBV体外感染。本研究拟基于该模型构建中和抗体检测方法,通过HBIG作为阳性对照进行预实验,探寻最佳的HBV感染剂量为1.25 GE（Genome Equivalent,基因组当量）/cell以及感染后上清检测时间为感染后第9天,通过检测上清中的HBeAg水平可得知样本的残存的病毒感染力,以最接近对照组的50%抑制率的稀释倍数作为该待测样品的中和抗体滴度（Neutralization Antibody Titer,NAT）。在相同确定条件下,进行了三次重复实验,CV值（coefficient of variation）为10%,说明检测体系的重复性较好。采用我们建立的Anti-HBV对164名来自厦门血站的健康献血志愿者进行了中和活性的评价,中和抗体滴度值由低到高从1到256不等,其中1代表中和抗体水平为阴性,高于1则为阳性。分析这164名志愿者血清样本的Anti-HBs水平和Anti-HBc水平,结果表明Anti-HBs水平与中和抗体滴度显着相关（Pearson相关系数≈0.70,p<0.05）,疫苗免疫产生及既往感染恢复产生的Anti-HBs对HBV感染均具有良好的保护作用（p<0.05）。但在Anti-HBs水平相近人群中（p=0.57）,既往感染人群（即Anti-HBc阳性人群）血清中和活性（log10（NAT）均值为1.05）要高于未曾感染HBV人群（logio（NAT）均值为0.77）。因此综合考虑Anti-HBs、Anti-HBc定量能更好的反映中和抗体滴度的水平。另外,本研究还用两种目前流行的Anti-HBs检测方法对Anti-HBs水平进行检测,发现双抗原夹心酶联免疫吸附测定法和化学发光微粒免疫法的定量结果基本一致（R=0.91,Kappa值为0.84,p<0.05）,均较好地反映Anti-HBs水平。综上,本研究基于HepG2-NTCP细胞模型建立了血清HBV中和抗体水平检测方法,并利用该方法初步分析了 164名厦门血站健康献血者的血清Anti-HBV抗体中和活性。该检测方法可通过检测血清中和抗体水平应用于接种疫苗后产生的保护性抗体评价,还可以通过分析单克隆/多克隆抗体中和活性对一些新型抗病毒药物进行筛选。另外,健康人群无法进行血清HBV中和抗体水平检测时,可通过综合考虑Anti-HBs、Anti-HBc 来初步评价疫苗针对 HBV 的保护性。
任玲龙,郭永建,罗玉兰[4]（2015）在《二甲基亚砜促进乙型肝炎病毒对HepG2细胞的吸附作用》文中研究表明目的初步探讨乙型肝炎病毒（HBV）感染经二甲基亚砜（DMSO）处理的HepG2细胞的早期吸附过程,为HBV体外感染机制的研究提供细胞学依据。方法将HepG2细胞分为DMSO处理组和对照组,分别以含有1.5%DMSO和不含DMSO的DMEM培养液培养4d,观察HepG2细胞形态的变化。另将ECV304细胞设为阴性对照组以DMSO处理,3组细胞培养24h后分别以HBV阳性血清孵育2h,收集胰酶消化液及HepG2、ECV304细胞,采用聚合酶链式反应（PCR）分别检测各组的HBV DNA;同时设立空白对照组,采用间接免疫荧光法（IIF）检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）在HepG2细胞上的定位。结果 DMSO处理组的HepG2细胞体积明显增大;DMSO处理组和对照组HepG2细胞内和胰酶消化液中均可检出HBV DNA,但DMSO处理组表达较强;IIF检测结果显示,DMSO处理组的HepG2细胞膜和细胞质的绿色荧光信号明显增强,而阴性对照组的HBV DNA及IIF检测均为阴性。结论 DMSO能在一定程度上促进HBsAg的吸附,从而有助于感染早期过程的实现。
刘舒凌[5]（2015）在《饿蚂蝗总黄酮抗乙型病毒性肝炎的作用及其机制研究》文中研究表明饿蚂蝗（Desmodium multiflorum DC.）,又名山蚂蝗、粘身草、红掌草、胃痛草等,为豆科山蚂蝗属植物饿蚂蝗的全株,分布于广西、广东、江西、福建、云南等地,具有清热解毒,健胃消食,止痛之功效。现代药理和中药化学研究表明,饿蚂蝗具有良好的生物活性,其化学成分主要为有机酸、甾体、萜类、黄酮类及酚类。在广西民间,饿蚂蝗用于治疗肝炎和肝腹水,具有较好的临床疗效。本研究的前期工作采用系统溶剂提取法对饿蚂蝗进行提取分离,同时进行了抗HBV的药效筛选工作。前期的研究表明饿蚂蝗乙醇提取物体外抗HBV的作用主要体现在乙酸乙酯部位;化学成分预试显示,乙酸乙酯部位可能含有较多的黄酮类成分。目前关于饿蚂蝗总黄酮的实验研究资料不多,对其抗HBV作用研究尚无文献报道。因此本文拟对饿蚂蝗总黄酮进行提取纯化,对其体内外抗HBV作用和保肝作用进行研究。本研究将为广西民间药材饿蚂蝗的进一步开发利用提供科学的理论基础,为新型抗HBV药物的研究和开发提供实验依据。第一章饿蚂蝗总黄酮的提取纯化及抗HBV活性确认实验一 饿蚂蝗总黄酮的提取纯化目的:采用乙醇提取法和AB-8大孔树脂吸附法,研究饿蚂蝗总黄酮的提取和纯化工艺。方法:以芦丁为对照品,乙醇为浸提溶剂,利用紫外分光光度法对饿蚂蝗总黄酮的提取率进行测定,通过对乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数进行正交试验,优选饿蚂蝗总黄酮的提取工艺。采用AB-8大孔树脂为吸附材料,以洗脱液中总黄酮量和总黄酮纯度为指标,考察上样液质量浓度、上样体积、洗脱剂浓度、洗脱流速和洗脱液用量,优化饿蚂蝗总黄酮的纯化工艺。结果:最佳提取纯化工艺为:60%乙醇提取,液料比12:1,提取3次,每次1h;提取后经AB-8大孔吸附树脂进一步纯化,上柱药液浓度以生药计为0.4g/mL,上样量为1.5倍柱床体积,以4倍柱床体积的70%乙醇洗脱,洗脱流速为2mL/min;纯化后总黄酮纯度为61.47%。结论:该工艺操作简单、稳定可行,适合饿蚂蝗总黄酮的提取纯化。关键词总黄酮,饿蚂蝗,大孔树脂,纯化实验二 饿蚂蝗体外抑制HBV的活性部位确认目的:比较饿蚂蝗醇提物（AEDM）和饿蚂蝗总黄酮（TFDM）体外对HBV的抑制作用。方法:通过CCK-8法观察AEDM和TFDM对HepG2.2.15细胞的影响,采用ELISA法检测分析AEDM和TFDM对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用。结果:AEDM和TFDM的半数中毒浓度（TC50）分别为621.83μg/mL和310.91μg/mL,对细胞的毒性均较小。AEDM对HBsAg和HBeAg的半数抑制浓度（IC50）分别为179.60μg/mL和168.59μg/mL,治疗指数（TI）分别为3.46和3.69;TFDM对HBsAg和HBeAg的IC50分别为56.25μg/mL和39.70μg/mL,TI分别为5.53和7.83。结论:饿蚂蝗总黄酮在体外具有抗HBV抗原的作用;饿蚂蝗体外抗HBV的作用与总黄酮含量呈正相关。第二章饿蚂蝗总黄酮体外抑制HBV DNA和cccDNA的作用研究目的:研究饿蚂蝗总黄酮（TFDM）对HepG2.2.15细胞HBVDNA复制及HBV cccDNA水平的影响。方法:将HepG2.2.15分为空白对照组、拉米夫定组（100μg/mL）、不同浓度 TFDM 组（1 00μg/mL、50μg/mL、25μg/mL）,分别给予相应的培养液,每2天换液一次,在6天时,收集上清液及细胞,采用荧光定量PCR法检测细胞内、外HBV DNA以及细胞内HBV cccDNA的拷贝数。结果:TFDM各剂量组能明显抑制细胞内、外HBV DNA的含量（P<0.01）以及细胞内HBV cccDNA的水平（P<0.05或P<0.01）,且抑制作用呈现明显的量效关系。结论:TFDM能够明显抑制HepG2.2.15细胞HBV DNA复制水平,对HBV cccDNA也具有抑制作用。第三章饿蚂蝗总黄酮对鸭乙型病毒性肝炎的作用研究目的:研究饿蚂蝗总黄酮（TFDM）对鸭乙型病毒性肝炎的作用。方法:采用鸭乙型肝炎病毒血清感染1日龄广西麻鸭。感染7d后采用PCR法筛选出DHBV DNA强阳性鸭,随机分为5组:模型组、3TC 阳性对照组（50mg/kg）、TFDM高、中、低剂量组（300、150、75mg/kg）,每组10只。另设正常对照组（经PCR筛选出的未造模DHBV阴性鸭）10只。各组从造模后第14d开始给药,每天灌胃给药1次,持续给药14d。每组动物分别于给药前0天（T0）、给药后7天（T7）、给药后14天（T14）、停药后3天（P3）自颈静脉采血,检测血清中DHBVDNA、DHBsAg和DHBeAg的水平、转氨酶（ALT,AST）的活性以及细胞因子IL-2和IFN-γ的含量变化。结果:TFDM能够降低T14和P3时鸭血清DHBV DNA载量以及DHBsAg、DHBeAg含量,停药后未见病毒反弹;降低T7、T14、P3时血清ALT和AST含量;升高T14时血清IL-2和IFN-γ水平。结论:TFDM具有抗鸭乙型病毒性肝炎作用,其作用机制与抑制DHBV病毒复制、保肝降酶、调节免疫功能有关。第四章饿蚂蝗总黄酮对刀豆蛋白A（ConA）所致小鼠免疫肝损伤的作用研究实验一饿蚂蝗总黄酮对ConA诱导的小鼠免疫肝损伤的影响目的:研究饿蚂蝗总黄酮（TFDM）对小鼠免疫性肝损伤的作用及其机制。方法:72只小鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性药联苯双酯组（200mg/kg）、TFDM 高、中、低剂量组（800、400、200mg/kg）,各组预防性灌胃给药10 d。第10 d,除正常对照组外,其余各组小鼠尾静脉注射刀豆蛋白A（Con A）20 mg/kg诱导免疫性肝损伤,8 h后测定小鼠肝、脾、胸腺指数（mg/g）,检测小鼠肝匀浆中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）的活性变化,流式细胞术测定全血中CD4+、CD8+T细胞亚群比率,ELISA法测定血清白介素-2（IL-2）、Y干扰素（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-4）的水平。结果:与模型组相比,TFDM能明显降低肝、脾指数,增大胸腺指数,显着降低小鼠肝匀浆中ALT、AST、MDA、NO含量和升高SOD活性,显着提高外周血CD4+、CD8+比率,降低血清中炎性细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的水平。结论:TFDM对免疫性肝损伤有保护作用,其机制可能与抗氧化损伤、调整T细胞亚群的活性和减少炎性细胞因子的释放有关。实验二急性毒性试验目的:评价TFDM的安全性,测定最大给药量。方法:SPF级小鼠20只随机分成2组:空白对照组和TFDM组。TFDM组以最大浓度和最大体积灌胃给药,空白对照组给予等容量蒸馏水。给药后连续14天观察动物的行为、外观、体重、进食、排泄等情况,以及主要脏器的大体改变及死亡情况。计算小鼠经口的最大给药量。结果:小鼠灌胃给药后,其饮食、活动、精神状态等体征均无异常变化,未见毒性反应及死亡发生。给药后小鼠体重增长正常。TFDM小鼠经口的最大给药量为12.5g/kg,相当于饿蚂蝗原生药578.0g/（kg·d）,是临床人用量（成人60kg体重,日用量30g药材）的1157倍。结论:TFDM经口给药的毒性很低。第五章饿蚂蝗总黄酮对HepG2.2.15细胞内部分抗病毒蛋白的基因表达和蛋白表达的影响目的:研究TFDM对HepG2.2.15细胞内部分抗病毒蛋白的基因表达和蛋白表达的影响,探讨TFDM抑制HBV在细胞内复制的可能机制。方法:HepG2.2.15分为空白对照组、不同浓度TFDM组（100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL）,分别给予相应的培养液,每2天换液一次,第6天收集细胞。选取JAK-STAT信号通路中的部分抗病毒蛋白如:信号转导与转录活化因子1（STAT1）、信号转导与转录活化因子2（STAT2）、2’,5’-寡腺苷酸合成酶1（OAS1）、RAN依赖蛋白激酶（PKR）和粘病毒抗性蛋白A（MxA）。采用RT-PCR法检测TFDM作用后细胞内STAT1、STAT2、OAS1、PKR和MxA转录产物mRNA水平的变化,免疫组化法和Western blot法检测STAT1、STAT2、OAS1、PKR和MxA蛋白表达水平的变化。结果:与空白对照组比较,TFDM可以明显上调细胞内STAT2、PKR和MxA的mRNA水平（P<0.05）,明显增强PKR和MxA的蛋白表达水平（P<0.01）。结论:TFDM可以诱导HepG2.2.15细胞内JAK-STAT信号通路中PKR和MxA的基因转录和蛋白表达。提示此通路可能是TFDM抑制HBV在肝细胞内复制的机制之一。
孙淑珍[6]（2013）在《IL2、ASGR1和Cav-1在乙型肝炎病毒入胞过程中的作用》文中研究说明背景：由于缺乏有效的体外乙肝病毒感染的模型,乙肝病毒入胞早期过程的研究进展十分缓慢,在一定程度上影响了乙型肝炎及其相关肝脏疾病的基础和临床研究。越来越多的研究表明受体在病毒入胞过程中发挥了一定的作用。目的：建立一个I-IBV体外自然感染HepG2细胞的模型,探讨与HBV入胞相关的分子和受体。方法：收集]3BeAg阳性、高拷贝（HBV-DNA>1×108copies/ml）乙肝病人血清；未注射过乙肝疫苗的乙肝两对半全阴的正常人血清；以及2.2.15细胞上清。用PEG沉淀和蔗糖密度梯度离心得到去除病毒的高拷贝病人血清和2.2.15细胞病毒颗粒。将高拷贝血清和2.2.15细胞的病毒混合物作为实验组,正常人血清和2.2.15细胞的病毒混合物作为阴性对照组,和HepG2细胞共孵育,用DMSO处理六天的HepG2细胞加实验组血清作为阳性对照组。24h后去除旧培养基,PBS清洗3次,胰酶消化重悬继续孵育。收集去感染后细胞上清和细胞。ELISA检测细胞培养上清中的HBsAg, PCR方法检测细胞培养上清中的HBVDNA,电镜观察细胞上清中的病毒颗粒,组织化学、共聚焦和western blot观察细胞中的HBcAg。然后利用抗体中和方法中和血清中的IL-2, IL-12,定量PCR观察进入细胞的HBcAg的mRNA。用RNA干扰降低HepG2细胞表面的ASGR1或者CAV-1含量,PCR、western blot方法观察细胞内HBcAg含量。结果：HBV高拷贝血清作为实验组自然感染的HepG2细胞上清中, ELISA检测到HBsAg并且持续到120h,PCR检测实验组细胞上清中的HBV DNA呈阳性,免疫电镜可以观察到细胞培养上清中Dane样颗粒和20nm左右的杆状颗粒和球形颗粒。共聚焦、组织化学、Western Blot观察到细胞内的HBsAg和HBcAg。用抗体中和血清中IL-2后RT-PCR方法检测发现细胞内HBcAg mRNA发达也减低。RNA干扰细胞膜上的ASGR1和cav-1后,用RT-PCR和WB检测细胞内HBcAg, mRNA水平和蛋白水平的核心蛋白的表达均有所下降。结论：建立了HBV阳性血清直接感染HepG2细胞的模型,IL-2, ASGR1,CAV-1在HBV入胞时发挥作用。
王帅,李杨,韩聚强,王少霞,范公忍,杨蕾蕾,袁静,胡大荣,曹建彪[7]（2012）在《HBV阳性血清对胎盘滋养层细胞的影响研究》文中研究说明目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）阳性血清对体外培养胎盘滋养层细胞的影响。方法体外培养胎盘滋养层细胞（JEG-3）,应用HBV阳性血清处理,分别于处理后24 h、48 h和72 h采用免疫组织化学SP法检测细胞中HBsAg蛋白的表达,PCR法检测细胞中HBV DNA,annexinⅤ/PI双标法检测细胞凋亡和坏死,透射电镜观察细胞超微结构的变化并寻找病毒颗粒。结果 HBV阳性血清处理后24～72 h,JEG-3细胞中HBsAg和HBV DNA呈阳性;处理后48 h,细胞坏死率显着增加（P<0.01）,凋亡率无明显变化（P>0.05）;细胞超微结构显示,JEG-3胞浆内出现较多空泡状结构,溶酶体明显增多,并可见病毒样颗粒。结论 HBV阳性血清可导致体外培养胎盘滋养层细胞的HBV感染,引起胎盘滋养层细胞损伤。
魏春山[8]（2012）在《叶下珠及其复方对HBx介导肝癌VEGFR3表达的影响》文中认为背景和目的：乙型肝炎病毒（HBV）感染形成乙型病毒性肝炎（hepatitis B,HB）,是危及全球人类健康的一种世界性传染病。HB或HBV相关肝病进展成肝癌的机制至今尚未完全清楚。肝细胞癌（hepatocelluar carcinoma, HCC）是世界发生率最高的恶性肿瘤之一,乙肝病毒x基因（hepatitis B virus X gene, HBx）及其编码产物（hepatitis B virus X antigene, HBxAg）,被认为在肝癌的发生发展过程中扮演着重要角色。在调节肿瘤血管生成方而,不同血管生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）及受体（VEGFR）发挥核心作用,而VEGFR3的作用有其独特性,它在发育的不同阶段发挥不同的作用。在本课题前期研究中,导师童光东教授已通过基础研究初步证实了HBV可能通过HBxAg影响肝癌的生成和发展,此后通过对乙肝相关肝癌癌前病变的研究,获得一系列早期癌变标志物,并发现早期癌变标志物之一VEGFR3可能与HBx存在一定相关性,从而提出了HBx可能影响肝癌VEGFR3表达的假说。同时,前期研究通过采用复方叶下珠（compound phyllanthus urinaria L.,CP）对人肝癌细胞动物模型及肝癌患者进行干预,结果表明CP具有直接抗HBxAg表达而抑制肝癌进展的作用。在此基础上,本研究设计建立稳定转染HBx和VEGFR3基因的肝癌细胞株,通过制作相关动物模型,并用中药叶下珠水提物（the aqueous extract of phyllanthus urinaria L.,AEP）进行处理；同时采用CP干预肝癌癌前病变患者,旨在进一步探讨HBx和VEGFR3在HB相关肝癌中的相关性及对肿瘤调节的机制,了解AEP及其复方（CP）对HB相关肝癌和癌前病变的作用机理,从而为进一步开发中药抗癌药物,及扩大临床推广应用提供证据支持。方法：1、首先构建转染HBx和VEGFR3的人肝癌HepG2稳定细胞株；PCR技术分别从HBV全基因组、人cDNA中扩增HBx和VEGFR3片段；将HBx和VEGFR3分别克隆至逆转录病毒载体质粒pBaBe-puro,构建重组质粒pBaBe-puro-HBx、 pBaBe-puro-VEGFR3,重组质粒与PIK包装质粒共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装产生重组逆转录病毒后,感染人肝癌细胞HepG2,获得转入HBx或VEGFR3的HepG2细胞。收集HepG2-HBx、HepG2-CAT、HepG2-VEGFR3细胞,用酶联免疫检测仪检测不同细胞增殖时间各细胞吸光度,通过流式细胞仪观察细胞周期；并收集各细胞RNA及蛋白质,进行RT-QPCR及western blot等检测,进一步验证HBx及VEGFR3在这些细胞中的表达情况。2、制作叶下株水提取物（AEP）和复方叶下珠制剂（复方叶下珠（CP）,组成：叶下珠30g、半枝莲30g、莪术15g、黄芪30g、山慈菇10g,由广东一方制药有限公司提供颗粒剂）。3、制作裸鼠颈部皮下移植瘤模型；选用Balb/c nu小鼠。4、动物管理：SPF饲养环境。4、分组：（1）动物实验：按SPSS17.0的随机数字法按动物编号进行完全随机排序,完成分组,每组6只,分别为：G1,生理盐水对照组、G2,HepG2-HBx细胞空白对照组、G3,HepG2-HBx细胞CTX治疗组、G4,HepG2-HBx细胞AEP治疗组、G5,HepG2-CAT细胞空白对照组、G6,HepG2-CAT细胞CTX治疗组、G7,HepG2-CAT细胞AEP治疗组、G8,HepG2-VEGFR3细胞空白对照组、G9,HepG2-VEGFR3细胞CTX治疗组、G10,HepG2-VEGFR3细胞AEP治疗组。分别予NS、NS、CTX、AEP、NS、 CTX、AEP、NS、CTX、AEP。AEP灌胃6次/周、NS用法同AEP、CTX腹腔注射5次/周。按CTX使用疗程：共使用30次（1疗程）,疗程结束时采集标本。（2）临床试验：筛选有癌前病变指征的肝硬化病例113例,实验组59例,对照组54例。入组前签署知情同意书。实验组采用CP口服,对照组不治疗。两组患者仅在肝功能异常是采用常规护肝治疗。5、取材：（1）动物：称量体重、常规摘眼球方法取血、颈椎脱臼法处死、取肿瘤、肝脏等。（2）患者：在治疗前、治疗12月、24月时分别抽取患者血清送检。6、观察指标及检测：动物：观察组织形态学：分别观察实验动物体重；瘤体大小、质量、形态等。生长曲线图绘制。常规HE染色。ELISA法测AFP水平。IHC检测HBx、VEGFR3表达。Western blot检测HBx、VEGFR3表达。患者：观察患者生存质量,检测血清VEGFR3等癌前病变标志物指标。7、统计学处理：运用SPSS17.0统计软件。两两比较用t检验。计数资料用卡方检验。计量资料组间比较用方差分析（单因素、多因素方差分析）。等级资料采用非参数检验。重复数据用可得复测量数据的方差分析。变量依存关系用回归分析。假设检验：P<0.05为有统计学意义。结果：1、成功克隆出HBx和VEGFR3基因,并经序列分析证实;获得重组逆转录病毒质粒pBaBe-puro-HBx、pBaBe-puro-VEGFR3;建立了携带HBx、VEGFR3的HepG2细胞；分别经RT-PCR及Western blot检测稳定表达。2、获得叶下株水提取物、叶下株水提物最大无毒剂量为15m/mL。3、不同组动物体重增长和时间存在交互作用（P<0.05）;4、移植瘤质量：（1）转染HepG2-HBx各组中对照组（G2）肿瘤生长最快,AEP组（G4）肿瘤生长最慢,经SNK法检验（表5）,三组间均有统计学意义（p<0.05）,且AEP组抑制作用较CTX组作用更强（P<0.05）。转染HepG2-CAT各组中,AEP组（G7）和CTX组（G6）肿瘤质量均低于对照组（P<0.05）,但AEP组与CTX组之间无统计学差异（P>0.05）。转染HepG2-VEGFR3各组中,AEP组（G10）和CTX组（G9）肿瘤质量均低于对照组（P<0.05）,但AEP组与CTX组之间无统计学差异（P>0.05）。（2）按NS、CTX及AEP不同处理因素分组,不同接种细胞组间比较均无统计学意义（P>0.05）。5、采用ELISA方法检测裸鼠血清AFP水平,AFP最小值1.27ng/mL,最大值24.01ng/mL,均数为3.7439±5.20ng/mL（mean±SD）。经Homogeneity方差齐性检验,Levene统计值为4.908,P=0.000,方差不齐；经非参数检验,F=3.772,P=0.062,各组之间无统计学意义。采用ELISA方法检测裸鼠血清VEGFR3水平,经Homogeneity方差齐性检验,Levene统计值为1.436,P=0.217,方差齐；经单因素方差分析,F=1.018,P=0.448,各组之间无统计学意义（P>0.05）。6、瘤组织HBx表达IHC检测：HBx表达IHC检测G2组表达最强,G3组阳性信号较弱、G4组表达最弱。组间两两比较结果：G2组和G3组、G2组和G4组之间比较均有统计学差异（P<0.05）,G3组与G4组相比无统计学意义（P>0.05）。提示AEP和CTX均可抑制移植瘤组织中HBx表达,但两者之间无差异。7、瘤组织HBx表达Western Blot检测：经Western Blot检测,接种HepG2-HBx细胞的模型中,AEP组HBx表达最少,但与CTX组相比无统计学意义（P>0.05）,AEP组和CTX组与NS组相比均有统计学意义（P<0.05）。表明AEP和CTX均具有抑制肿瘤细胞中HBx表达的作用,但二者之间无统计学差异。8、瘤组织VEGFR3表达IHC检测结果示：模型对照组中转染HBx基因（G2组）和VEGFR3基因（G8组）的组别阳性细胞染色率均在75%以上,其中G8组（图3.6-G8）表达最强,但与G2组相比无统计学意义（P>0.05）,G5组表达最低。G3组表达低于G4、G6组（P<0.05）,也低于G9组（P<0.05）,G9组低于G8组（P<0.05）,但与G10组比较无统计学意义（P>0.05）。9、瘤组织VEGFR3表达Western Blot检测（1）接种同一细胞株的不同处理组比较：AEP组VEGFR3表达最低,与CTX组比较无统计学差异（P>0.05）,NS组表达最高。AEP组和CTX组与NS组相比均有统计学差异（P<0.05）。（2）接受同一处理的不同接种细胞组比较接受NS处理的不同模型组比较：接种HepG2-VEGFR3细胞组VEGFR3表达最高,但与HepG2-HBx组相比无统计学意义（P>0.05）。二组VEGFR3表达均高于接种HepG2-CAT细胞组（P<0.05）。提示HBx可能具有上调肝癌细胞中VEGFR3表达的作用。接受AEP处理的不同模型组比较：接种HepG2-VEGFR3细胞组VEGFR3表达最高,与接种HepG2-HBx细胞组相比有统计学意义（P<0.05）,接种HepG2-HBx细胞组表达最低,与接种HepG2-VEGFR3细胞（P<0.01）、HepG2-CAT细胞组相比均有统计学意义（P<0.05）。表明AEP可抑制各组细胞VEGFR3表达,并明显降低HBx组VEGFR3表达。提示其抑制VEGFR3作用与HBx有一定关联。接受CTX处理的不同模型组比较：接种HepG2-VEGFR3细胞组VEGFR3表达最高,但与HepG2-HBx组相比无统计学意义（P>0.05）。二组VEGFR3表达均高于接种HepG2-CAT细胞组（P<0.05）。10、CP治疗后,实验组肝癌癌前病变患者在24月临床症状改善、肝纤三项、降低HBV-DNA水平等方面较对照组有统计学差异（P<0.05）,而在12月临床症状改善、肝功能改善、HBeAg血清学转换等方面与对照组相比无统计学差异（P>0.05）。在所检测的6个抗体中,抗URG11和抗VEGFR3发生率最高,两组阳性率皆在60%以上,而治疗组经过治疗后两抗体皆有下降,而对照组有所上升,比较有统计学意义（P=0.0417、P=0.0452）。观察结束时,共11例发生肝癌,其中对照组9例,治疗组2例,两组比较有统计学意义（P<0.05）。结论：1.VEGFR3在Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型肿瘤组织中均有表达且与HBx表达呈正相关,二者不是独立的,HBx可介导肝癌细胞VEGFR3高表达。2.叶下珠不仅对HBx具有直接抑制作用,同时也直接抑制VEGFR3表达,还能通过抑制HBx表达间接抑制VEGFR3水平,实现对对乙肝相关性肝癌的抑制作用；同时,叶下珠对HBx阴性肝癌也有抑制作用,可能正足通过VEGFR3途径得以实现的,为进一步研究其它非乙型肝炎相关性肝癌的治疗提供了一条思路。而CTX也可直接抑制肝癌细胞中VEGFR3表达,但不通过抑制HBx表达发挥作用。叶下珠可抑制荷瘤裸鼠癌组织生长,但对动物本身体重增长无明显影响。3.通过CP对肝癌癌前病变的临床研究,表明VEGFR3在确诊肝癌及肝癌前病变患者中高表达,证实可作为肝癌癌前病变的预测因素之一；CP可抑制肝癌癌前病变患者VEGFR3表达水平，提示CP可能通过调竹VEGFR3表达等途径发挥抑制肿瘤作用。结合实验研究结论,叶下珠可能通过HBx直接或间接抑制VEGFR3表达。4.本研究中,HBx与VEGFR3及AFP水平在皮下移植瘤裸鼠血清及肝脏的表达不典型,似与临床实际有一定差异,主要原因可能为：选用了皮下移植瘤模型而不是原位癌模型；样本量的原因；或检测试剂本身及使用、人员操作等因素等,此外,成年动物血清中VEGFR3表达本身较低,故而使结果可能出现一定偏倚,存在一定的局限性。但由于本课题设计时考虑了可能的干扰因素，严格设立了对照组（阳性和阴性对照）在一定程度上消除了以上偏倚。条件许可下进一步扩大样本量并优选更接近于人体生化环境的动物模型,将更有利于提高研究结果的可靠性。以上结果和结论,为进一步探讨HBx及VEGFR3的相关性及对肝癌的防治作用提供了载体、口的细胞株等物质条件,并为乙肝病毒x基因相关肝癌发生机制提供了新的思路,同时为中药防治肿瘤的应用推广提供了证据支持,具有较大的社会价值和现实意义。为此,进一步挖掘整理相关实验结果,探索更多HBx及VEGFR3与肝癌进程中的内在关联是木课题组将着重关注的后续工作之一。此外,通过进一步纯化中药制剂,分析提炼药物有效成分；并通过优化方案设计,扩大样本量,优选动物模型等手段,将有助于进一步提高结果可靠性,并将有利于指导筛选通过HBx介导VEGFR3表达防治肝癌的中药开发和应用,这也是本课题组下一步将着力开展的工作。
宋秀霞,居丽雯,卫国荣,姜庆五[9]（2012）在《HBV阳性血清体外感染HepG-2细胞方法建立》文中研究说明目的建立乙型肝炎病毒（HBV）阳性血清体外感染人肝癌细胞系HepG-2的方法。方法低温同步化处理HepG-2细胞后用高浓度HBV阳性血清与含有4%聚乙二醇的无血清伊格尔极限必需培养基（MEM）共孵育HepG-2细胞,设阴性对照组和空白对照组;18 h后加入含10%胎牛血清的MEM继续培养6 d,每隔24 h收集细胞和培养上清,荧光定量PCR检测HBV DNA,间接免疫荧光技术检测细胞内乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。结果 HBV阳性血清感染组HepG-2细胞内和培养上清中在感染后第1 d可检测到HBV DNA,分别为（16.04±7.99）×103、（8.84±3.97）×103 copies/mL,细胞内DNA含量在第2 d达到（3.51±1.86）×105 copies/mL,然后逐渐下降,在第4 d降到检测下限以下,而培养上清中病毒DNA在检测的时间内逐渐升高,在第6天达到（8.41±5.34）×105 cop-ies/mL;间接免疫荧光检测感染组细胞膜和胞浆中均有HBsAg表达;传代培养感染细胞后,在第1代细胞培养上清和细胞内均可检测到HBV DNA（3.58×105、7.34×105 copies/mL）,第2代培养上清中可检测到少量HBV DNA（2.89×103 copies/mL）,但细胞内检测到HBV DNA低于检测下限（896 copies/mL）,第3代细胞的上清和细胞内均未检测到HBV DNA。结论 HBV阳性血清在一定条件下可以感染HepG-2细胞,病毒能在细胞内进行短期复制。
王帅[10]（2011）在《HBV宫内传播机制的蛋白质组学和相关miRNA研究》文中认为我国是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染高流行区,HBV感染及其导致的肝硬化和肝癌等疾病严重影响人们的健康。HBV主要通过血液、母婴及性接触传播,其中母婴垂直传播主要发生在围产期,阻断母婴传播是目前控制HBV感染流行的关键,而HBV宫内跨胎盘传播机制是母婴传播阻断研究的重点和难点。HBV宫内传播机制主要有胎盘渗漏学说、胎盘感染学说及外周血单核细胞感染学说等几种假说,但病毒感染宿主细胞是一个复杂的内化过程,多层次多个分子可能参与该过程,目前有关HBV跨胎盘宫内感染的机制研究尚不够深入也远未阐明,亦无有效阻断措施,深入探讨HBV宫内传播机制对于HBV宫内跨胎盘传播的有效阻断具有理论和实际意义。蛋白质组学技术可用来比较疾病与正常蛋白质样品间的表达水平,是揭示疾病分子机制、发现诊断标志物以及寻找药物新靶标的有效平台,尚未见HBV宫内跨胎盘传播机制的蛋白质组学研究报道。此外,病毒感染宿主细胞后,可导致宿主细胞中的miRNA表达谱发生变化,HBV和宿主细胞之间通过miRNA进行的相互调节对于HBV宫内感染的发生发展可能具有一定作用,亦未见相关研究报道。因此,本论文利用蛋白质组学技术筛选HBV阳性产妇胎盘差异表达蛋白,并建立胎盘滋养层细胞体外HBV感染模型,探讨HBV感染后细胞中miRNA的表达变化,从蛋白质组和miRNA两个层次深入探讨HBV如何跨胎盘宫内传播,可望从新的角度对HBV宫内跨胎盘传播的机制予以揭示。方法:1.以HBV阳性产妇胎盘为研究对象,以正常产妇胎盘为对照,利用MALDI-TOF和ESI-MS/MS进行分析,建立正常胎盘蛋白双向电泳（2-DE）参考图谱;采用比较蛋白质组学方法,筛选HBV阳性与正常产妇胎盘组织的差异表达蛋白,分析评价部分差异蛋白在HBV跨胎盘传播中的功能及意义。2.体外培养胎盘滋养层细胞（JEG-3）,应用HBV阳性血清处理,采用ELISA法检测感染细胞培养上清中的HBsAg、免疫组织化学SP法检测细胞中HBsAg蛋白的表达、PCR法检测细胞中HBV DNA的表达、AnnexinⅤ/PI双标法检测细胞凋亡和坏死,透射电镜观察细胞超微结构的变化并寻找病毒颗粒。3.应用HBV阳性血清处理JEG-3细胞,采用miRNA芯片进行处理前后细胞miRNA表达谱的比较,并对差异miRNA的靶基因进行预测和生物学功能分析。结果:1.建立了正常足月胎盘总蛋白2-DE参考图谱;在pH4-10的合成图谱上检测到405个蛋白质点,鉴定出157个蛋白点对应的104个蛋白,其中24个蛋白对应多个蛋白质点,包括细胞结构蛋白、细胞支架蛋白等;所鉴定蛋白质中有部分功能不明蛋白质存在。共筛选出HBV感染产妇胎盘蛋白中的56个差异表达蛋白点,鉴定出24个差异蛋白;差异蛋白中有14个表达上调,10个下调;差异蛋白质中包括了酶类、调节蛋白、转运蛋白、结构蛋白、支架蛋白、保护蛋白及功能未知蛋白等。2.HBV阳性血清处理后,胎盘滋养层细胞JEG-3培养上清中HBsAg呈阳性;JEG-3细胞中HBsAg和HBV DNA呈阳性;HBV阳性血清处理后细胞坏死率显着增加,凋亡率无明显变化;HBV阳性血清处理后JEG-3细胞超微结构的改变表现为胞浆内出现较多空泡状结构,溶酶体明显增多,并可见病毒样颗粒。3.与正常血清处理细胞相比,HBV阳性血清处理后JEG-3细胞中高表达的miRNA包括:has-miR-197、has-miR-32、has-miR-125a-3p、has-miR-20a、has-miR-210和has-miR-574-3p;未发现差异显着的低表达has-miRNA。结论:1.成功建立了正常足月胎盘总蛋白2-DE参考图谱;鉴定得到104个蛋白质,其中部分蛋白质可能存在较多翻译后修饰,其修饰的多样性反映出这些蛋白在胎盘发育中的重要性;发现功能不明蛋白在胎盘发育过程中的存在。筛选鉴定得到HBV感染产妇胎盘蛋白表达谱中的24个差异蛋白;其中包括多种类别,热休克蛋白、肌动蛋白、膜联蛋白等差异蛋白可能与HBV跨胎盘传播有关。2.HBV阳性血清可导致体外培养胎盘滋养层细胞的HBV感染,建立与体内HBV感染胎盘滋养层细胞条件接近的细胞感染模型;HBV阳性血清可导致胎盘滋养层细胞出现溶酶体大量增多等形态结构改变,并可导致细胞坏死。3.HBV阳性血清处理胎盘滋养层细胞后,细胞miRNA表达谱发生变化,差异表达的miRNA包括:has-miR-197、has-miR-32、has-miR-125a-3p、has-miR-20a、has-miR-210和has-miR-574-3p,表明miRNA可能在HBV感染中发挥调控作用。
二、HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验研究（论文提纲范文）
（2）HBV相关肝癌外泌体通过激活CMA途径诱导肝癌细胞化疗抵抗的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 HBV相关肝癌外泌体通过激活CMA途径诱导肝癌细胞化疗抵抗的机制研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 主要仪器与材料 |
| 1.1.2 主要方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 奥沙利铂治疗肝癌患者的效果分析 |
| 1.2.2 HBV通过外泌体下调肝癌细胞的化疗敏感性 |
| 1.2.3 外泌体通过激活CMA途径进而下调肝癌细胞化疗敏感性 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第2章 综述 肝癌耐药的分子学研究进展 |
| 2.1 肝癌对化疗耐药的机制研究进展 |
| 2.1.1 药物转运蛋白表达增加,加速肿瘤细胞内药物的排出 |
| 2.1.2 细胞凋亡抵抗相关基因 |
| 2.1.3 肝癌干细胞与耐药 |
| 2.1.4 细胞自噬与肝癌耐药 |
| 2.2 HBV与肝癌耐药 |
| 2.3 外泌体在肿瘤耐药中的作用 |
| 2.4 非编码RNA与肝癌耐药 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位论文数据集 |
（3）血清HBV中和抗体水平检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1 嗜肝DNA病毒科 |
| 1.2 乙肝病毒的病毒结构 |
| 1.3 病毒基因组结构 |
| 1.4 乙肝病毒的编码蛋白 |
| 1.5 乙肝病毒基因型 |
| 2 乙型肝炎病毒感染 |
| 2.1 乙肝病毒流行情况 |
| 2.2 乙肝病毒传播 |
| 2.3 乙肝病毒感染所致相关疾病 |
| 3 乙肝病毒的预防和治疗 |
| 3.1 乙肝疫苗 |
| 3.2 乙肝免疫球蛋白 |
| 3.3 抗病毒治疗 |
| 4 乙肝病毒体外模型 |
| 4.1 乙肝病毒体外复制模型 |
| 4.2 乙肝病毒体外感染模型 |
| 5 乙肝病毒病毒学指标和血清标志物 |
| 5.1 外膜抗原及其抗体 |
| 5.2 乙肝核心抗体 |
| 5.3 其他病毒血清标志物以及乙肝病毒核酸 |
| 6 本论文的研究目的、意义和思路 |
| 第二章 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要耗材 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 常用的分子细胞生物学实验试剂 |
| 1.5 实验用溶液及培养基配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 基本细胞实验操作 |
| 2.2 不同细胞的培养方法 |
| 2.3 HBV的生产 |
| 2.4 Real time PCR定量检测HBV DNA |
| 2.5 细胞感染及血清中和实验的操作步骤 |
| 2.6 PreS1-binding实验 |
| 2.7 常规的免疫实验方法 |
| 2.8 血清样本抗体检测 |
| 3 研究样本 |
| 4 统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 志愿者血清中和抗体滴度(NAT)检测方法的建立 |
| 1.1 细胞感染模型的分析 |
| 1.2 确定中和活性实验感染剂量感染检测时间点 |
| 1.3 中和抗体检测系统稳定性 |
| 1.4 中和抗体滴度检测方法 |
| 2 志愿者血清抗体检测 |
| 3 志愿者血清基本特征分析 |
| 4 比较血清基线抗体水平和血清中和抗体滴度之间的关系 |
| 4.1 Anti-HBs水平与血清中和抗体滴度之间的关系 |
| 4.2 Anti-HBc水平与血清中和抗体滴度之间的关系 |
| 5 血清中和抗体滴度的单因素分析及多因素回归分析 |
| 第四章 讨论 |
| 1 建立血清中和抗体水平检测方法 |
| 2 血清样本乙肝相关抗体的检测 |
| 3 血清中和抗体水平检测方法应用于164名健康志愿者血清样本评价 |
| 第五章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）二甲基亚砜促进乙型肝炎病毒对HepG2细胞的吸附作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（5）饿蚂蝗总黄酮抗乙型病毒性肝炎的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩略语表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 饿蚂蝗总黄酮的提取纯化及抗HBV活性确认 |
| 实验一 饿蚂蝗总黄酮的提取纯化 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 饿蚂蝗体外抑制HBV的活性部位确认 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 饿蚂蝗总黄酮体外抑制HBV DNA和cccDNA的作用研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 饿蚂蝗总黄酮对鸭乙型病毒性肝炎的作用研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 饿蚂蝗总黄酮对刀豆蛋白A所致小鼠免疫肝损伤的作用研究 |
| 实验一 饿蚂蝗总黄酮对刀豆蛋白A诱导的小鼠免疫肝损伤的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 急性毒性试验 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 饿蚂蝗总黄酮对HepG2.2.15细胞内部分抗病毒蛋白的基因表达和蛋白表达的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 综述 中草药及其提取物抑制HBV的作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（6）IL2、ASGR1和Cav-1在乙型肝炎病毒入胞过程中的作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 高拷贝血清感染细胞模型的建立 |
| 第二部分 细胞因子在乙肝病毒入胞时发挥的作用 |
| 第三部分 细胞膜受体在HBV入胞时的作用研究 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）叶下珠及其复方对HBx介导肝癌VEGFR3表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一章 HBx与VEGFR3在肝癌进程中的作用及叶下珠防治现状 |
| 第一节 乙型肝炎病毒X基因在肝癌发生发展中的作用 |
| 一、HBx的结构与生物学功能 |
| 二、HBx基因在HCC发生发展中的作用 |
| (一) HBx基因刺激HBV复制及在慢性肝病发病中的意义 |
| (二) HBx基因及其产物的表达 |
| (三) HBx的表达产物具有反式激活作用 |
| (四) HBx作用于凋亡的途径 |
| (五) 其它因素 |
| 三、HBx在HCC诊断与治疗中的研究现状 |
| 第二节 血管内皮生长因子及受体与肝癌发生发展的关系 |
| 第三节 HBx与VEGFR3在肝癌进程中的相关性研究现状 |
| 第四节 叶下珠及其复方防治乙肝相关肝癌的实验与临床研究进展 |
| 一、中医学对肝癌的认识 |
| 二、叶下珠及其复方防治肝癌的研究进展 |
| (一) 中医药防治肝癌的机制研究 |
| (二) 叶下珠及其复方防治肝癌的临床应用现状 |
| 三、叶下珠及其复方对HBx相关肝癌VEGFR3表达的影响作用机理探讨 |
| 第二章 HBx和VEGFR3逆转录病毒载体的构建及在HepG2细胞中的稳定表达 |
| 一、材料 |
| (一) 主要试剂 |
| (二) 主要仪器 |
| (三) 试剂配方 |
| 二、方法 |
| (一) HBx基因逆转录病毒载体的构建 |
| (二) 构建pBaBe-puro-VEGFR3表达载体 |
| (三) 构建pBaBe-puro-CAT表达载体 |
| (四) HBx感染人肝癌细胞 |
| (五) VEGFR3感染人肝癌细胞 |
| (六) CAT感染人肝癌细胞 |
| (七) 稳定细胞株的鉴定 |
| (八) MTT实验 |
| (九) 细胞周期 |
| 三、结果 |
| (一) 基因测序 |
| (二) 重组逆转录病毒载体的构建与鉴定 |
| (三) 稳定细胞株的鉴定 |
| (四) 获得稳定表达细胞株 |
| 四、讨论 |
| 第三章 叶下珠对HBx相关肝癌VEGFR3表达的实验研究 |
| 第一节 叶下株提取物的制备和对肝癌细胞的毒性实验 |
| 一、叶下珠培养液和血清制备 |
| (一) 叶下珠培养液制备方法 |
| (二) 叶下珠血清的制备 |
| 二、药物细胞毒性实验 |
| 三、结果与结论 |
| 第二节 HBx和VEGFR3过表达肝癌细胞动物模型的制作及叶下珠作用研究 |
| 一、材料 |
| (一) 实验细胞 |
| (二) 主要器材 |
| (三) 上要试剂 |
| (四) 实验用药 |
| (五) 实验动物 |
| 二、方法 |
| (一) 试剂配制 |
| (二) 细胞扩增 |
| (三) 动物管理 |
| (四) 实验取材 |
| (五) 观察指标及检测 |
| (六) 统计学分析 |
| 三、结果 |
| (一) 造模情况 |
| (二) 裸鼠生长状况 |
| (三) 肿瘤生长情况 |
| (四) 血清AFP检测结果 |
| (五) 血清VEGFR3表达 |
| (六) HBx表达IHC检测 |
| (七) HBx表达Western Blot检测 |
| (八) VEGFR3表达IHC检测 |
| (九) VEGFR3表达Western Blot检测 |
| 四、讨论 |
| (一) 皮下移植瘤模型的选择 |
| (二) 关于动物生长状况 |
| (三) 关于血清AFP水平和VEGFR3水平 |
| (四) 关于HBx的表达 |
| (五) 关于VEGFR3的肝癌组织学表达 |
| (六) 关于VEGFR3的Western Blot检测 |
| (七) 关于叶下珠抗肿瘤作用机理 |
| 第四章 复方叶下珠对HBx相关肝癌VEGFR3表达的临床研究 |
| 一、临床资料 |
| 二、研究方法 |
| (一) 病例筛选 |
| (二) 中药配方 |
| (三) 治疗方案 |
| (四) 疗效观察 |
| (五) 疗效判定 |
| (六) 统计学处理 |
| 三、结果 |
| (一) 入组患者基本特征 |
| (二) 临床表现改善情况 |
| (三) 肝功能及肝纤三项改善情况 |
| (四) 乙肝两对半和HBV-DNA定量 |
| (五) 清肝癌前抗体检测情况 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 主要缩略词中英文对照表 |
| 2 附图 |
| 在学期间发表论文及参与课题情况 |
| 致谢 |
（9）HBV阳性血清体外感染HepG-2细胞方法建立（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 HepG-2细胞 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 HepG-2细胞培养 |
| 1.2.2 HepG-2细胞的HBV阳性血清感染 |
| 1.2.3 HBV感染HepG-2细胞的传代 |
| 1.2.4 HepG-2细胞培养上清和HepG-2细胞内HBV DNA检测 |
| 1.2.5 HepG-2细胞内HBsAg检测 |
| 2 结 果 |
| 2.1 形态学观察 |
| 2.2 HepG-2细胞培养上清和HepG-2细胞内HBV DNA检测 (图1) |
| 2.3 HepG-2细胞内HBsAg检测 (图2) |
| 2.4 HBV感染HepG-2细胞的传代 |
| 3 讨 论 |
（10）HBV宫内传播机制的蛋白质组学和相关miRNA研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 HBV 跨胎盘宫内传播的蛋白质组学研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HBV阳性血清对胎盘滋养层细胞的HBV 感染及细胞生物学行为的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HBV 感染对胎盘滋养层细胞miRNA 表达谱的影响及意义 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 文献综述一 HBV 宫内跨胎盘传播研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 人类胎盘蛋白组学研究现状 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
四、HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验研究（论文参考文献）
- [1]入胞抑制剂Myrcludex-B合成肽对HBV感染HepaRG细胞体外感染模型的抑制作用研究[J]. 杨佳奇,李红. 中华肝脏病杂志, 2020(06)
- [2]HBV相关肝癌外泌体通过激活CMA途径诱导肝癌细胞化疗抵抗的机制研究[D]. 刘殿星. 华北理工大学, 2019(01)
- [3]血清HBV中和抗体水平检测方法的建立及初步应用[D]. 高颖. 厦门大学, 2017(06)
- [4]二甲基亚砜促进乙型肝炎病毒对HepG2细胞的吸附作用[J]. 任玲龙,郭永建,罗玉兰. 国际检验医学杂志, 2015(23)
- [5]饿蚂蝗总黄酮抗乙型病毒性肝炎的作用及其机制研究[D]. 刘舒凌. 广西医科大学, 2015(08)
- [6]IL2、ASGR1和Cav-1在乙型肝炎病毒入胞过程中的作用[D]. 孙淑珍. 华中科技大学, 2013(07)
- [7]HBV阳性血清对胎盘滋养层细胞的影响研究[J]. 王帅,李杨,韩聚强,王少霞,范公忍,杨蕾蕾,袁静,胡大荣,曹建彪. 中国体视学与图像分析, 2012(03)
- [8]叶下珠及其复方对HBx介导肝癌VEGFR3表达的影响[D]. 魏春山. 广州中医药大学, 2012(09)
- [9]HBV阳性血清体外感染HepG-2细胞方法建立[J]. 宋秀霞,居丽雯,卫国荣,姜庆五. 中国公共卫生, 2012(01)
- [10]HBV宫内传播机制的蛋白质组学和相关miRNA研究[D]. 王帅. 第三军医大学, 2011(07)