一、基于苯丙氨酸解氨酶的生物传感器线性化研究（论文文献综述）
朱灵桓[1]（2021）在《代谢工程改造酿酒酵母生产β-苯乙醇》文中认为β-苯乙醇（2-phenylethanol,2-PE）是一种具有玫瑰香气的芳香醇,因其优越的物化性质而被广泛应用于食品、日化、医药等领域。目前β-苯乙醇的工业生产方法以成本较高的物理提取法和污染严重的化学合成法为主,这极大地限制了β-苯乙醇的应用范围。利用微生物合成法制备β-苯乙醇具有产品品质优良、环境友好等优势,逐渐成为国内外研究的热点。本课题以酿酒酵母CICC31906 WT-A为研究对象,围绕β-苯乙醇的合成路径解析展开。通过莽草酸途径的改造,实现β-苯乙醇以葡萄糖为前体的从头合成;通过艾氏途径的异源酶表达,建立氨基受体回补的高效合成策略;基于组学技术,在酿酒酵母抗β-苯乙醇胁迫及高产菌株中,解析合成途经相关的调控机制,挖掘关键基因。主要研究内容和主要成果如下:（1）在酿酒酵母中构建以葡萄糖为前体的芳香醇合成途径。解除关键酶的反馈抑制,筛选并表达抗反馈抑制的异源酶,分别为大肠杆菌来源的抗反馈抑制的DAHP合酶(由基因aro GD146N编码)和分支酸变位酶/预苯酸脱水酶双功能酶(由基因phe Afbr编码)。发现了限制酿酒酵母五功能酶Aro1p反应速率的关键节点是莽草酸,表达了大肠杆菌来源的莽草酸激酶基因aro L和莽草酸脱氢酶基因ydiB。敲除L-苯丙氨酸转氨酶基因ARO9同时过量表达苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10以减少苯丙酮酸分流,并比较敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因ZWF1和过表达酮醛转移酶基因TKL1的合成效果。基于上述整合与游离高效表达系统的芳香醇合成途径的组装和表达,酿酒酵母以葡萄糖为碳源、酵母粉与不含硫酸铵和氨基酸的YNB为氮源,合成酪醇与β-苯乙醇的产量分别提高至543 mg/L和641 mg/L,是对照菌株WT-A的5.7倍和6.1倍。（2）利用异源酶的表达在酿酒酵母中搭建β-苯乙醇的高效转化途径。通过单因素筛选,将大肠杆菌来源的L-苯丙氨酸转氨酶Tyr B、乳酸乳球菌来源的苯丙酮酸脱羧酶Kdc A和酿酒酵母来源的乙醛脱氢酶Adh2融合表达于酿酒酵母中,以L-苯丙氨酸为主要氮源的摇瓶发酵得到β-苯乙醇产量为3.13 g/L。其次,引入链霉菌来源的L-谷氨酸氧化酶,实现转氨反应的氨基受体α-酮戊二酸的回补。发现丙酮酸脱羧酶基因PDC5的缺失对β-苯乙醇的合成具有明显的促进作用,整合上述因素对艾氏途径重构优化,以6.7g/L的L-苯丙氨酸为前体进行发酵,β-苯乙醇的产量由对照菌株WT-A的2.88 g/L提高至3.59 g/L,对L-苯丙氨酸的摩尔转化率为0.72 mol/mol。（3）基于转录组学,解析PDC5的敲除促进β-苯乙醇合成的调控机制。酿酒酵母pdc5△突变株RM22在以L-苯丙氨酸为前体的培养基中β-苯乙醇产量比对照菌株WT-A高28%。通过对照菌株WT-A和突变株RM22的转录组测序分析,发现涉及氧化还原、胁迫应答等功能的87个基因发生差异表达,其中60个基因显着上调,27个基因显着下调;与此相关的有27个途径,包括细胞内代谢、次级代谢产物的生物合成和氨基酸的生物合成等。通过对β-苯乙醇合成相关的差异表达基因进行分析与验证,确定编码芳香族氨基酸转氨酶基因ARO9的上调是引起菌株RM22中β-苯乙醇合成量增加的主要原因。（4）基于重测序与比较基因组学,在酿酒酵母中挖掘耐受和合成β-苯乙醇的关键基因。通过适应性进化的方法筛选出耐受高浓度β-苯乙醇胁迫的酿酒酵母菌株AD032,其耐受β-苯乙醇和合成β-苯乙醇的能力与对照菌株WT-A相比都有显着提高。从此菌株出发,得到的重组菌株KM032(AD032 pdc5△PTPI-tyr B-kdc A-ADH2 PTPI-LGOX)以6.7 g/L的L-苯丙氨酸为前体进行发酵,β-苯乙醇的产量为4.26 g/L,对L-苯丙氨酸的摩尔转化率为0.86 mol/mol。通过对菌株AD032的重测序和比较基因组学分析,发现涉及生物过程、细胞过程和分子功能等的113个基因或ORF的191个氨基酸位点发生突变。进一步探讨和挖掘与β-苯乙醇代谢相关的关键基因,突变基因中己糖转运蛋白（HXTs）、泛素（UBI4）以及相关调控因子（SWI1-SNF2）的过表达均能显着提高酵母细胞合成β-苯乙醇的能力。假定的芳基乙醛脱氢酶编码基因AAD15及突变体均不能将苯乙醛还原为β-苯乙醇。
聂也森[2]（2021）在《无细胞合成体系中丙二酸单酰辅酶A再生的研究》文中研究表明丙二酸单酰辅酶A,也称丙二酰辅酶A,是一种辅酶A的衍生物,主要用于脂肪酸、聚酮类化合物和平台化合物的合成,相关产品具有极高的应用价值与前景。但是,丙二酰辅酶A分离纯化困难、价格昂贵,限制了它在相关化合物生产中的应用。传统策略集中于细胞内源丙二酰辅酶A的利用,通过改造丙二酰辅酶A的代谢途径增加其胞内含量,以进一步提高下游产物的产量。但传统方法需要针对不同产品对细胞内相关通路分别进行设计,过程耗时,操作繁琐、复杂,且难以达到理想效果。本研究旨在建立一种丙二酰辅酶A体外再生体系,以克服传统丙二酰辅酶A应用策略中的弊端。基于细胞内丙二酰辅酶A的合成途径,我们设计了一套丙二酰辅酶A的再生体系,并将其应用于柚皮素的体外合成。首先,分别克隆大肠杆菌乙酰辅酶A合成酶（ACS）基因和酵母乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）基因至pET-32a（+）和pGAP-Neo表达载体,经表达与纯化后获得ACS与ACC1。然后,利用本课题组构建的表达具有4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL1）、查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）活性的三功能酶（4CC）的重组质粒,诱导表达、纯化4CC。接着,利用纯化的ACS、ACC1和4CC建立基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成体系,并以4-香豆酸为底物,在体外成功合成了柚皮素。最后,优化了影响柚皮素产量的一系列参数,包括缓冲液体系pH、底物浓度、反应温度、反应时间等。在100 μL体系包含100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、100 mM 磷酸钾缓冲液（pH 7.5）、10%甘油、5 mM MgCl2、0.1 mg/mLBSA、1%DMSO、1mMβ-巯基乙醇、6mMATP、1 mMCoA、10mM 醋酸钠、50 mM 碳酸氢钠、0.6 mM 4-香豆酸、60 μg/mL ACS、60 μg/mL ACC1、60 μg/mL 4CC,最佳反应温度为30℃,最佳反应时间为4 h,柚皮素产量达3.91±0.23 mg/L。综上所述,本研究建立了丙二酰辅酶A的体外再生体系,并在此基础上实现了柚皮素的体外酶促合成,从而显着降低了合成目标产物时因昂贵的丙二酰辅酶A带来的高成本,并为丙二酰辅酶A的其它下游产物的生产提供了一条新思路。
杨波[3]（2021）在《重组大肠杆菌全细胞合成覆盆子酮的研究》文中指出覆盆子酮是覆盆子果中的主要香气成分,是一种重要的香精香料单体,在食用香精、化妆品、农业杀虫剂、医药等方面有着广泛的应用。目前覆盆子酮的生产主要采用化学法,随着人们对天然香精香料的日益青睐,通过生物技术法合成覆盆子酮深受关注。本文研究了在大肠杆菌中共表达姜油酮合成酶（RiRZS1）和葡萄糖脱氢酶（SyGDH）,利用全细胞催化合成覆盆子酮,并对合成覆盆子酮的直接前体对羟基亚苄基丙酮的生物合成做了初步研究。具体内容如下:（1）构建共表达RiRZS1与SyGDH的重组大肠杆菌,将来源于悬钩子（Rubus idaeus）的覆盆子酮/姜油酮合成酶Ri RZS1和来源于嗜酸热原体（Thermoplasma acidophilum）的葡萄糖脱氢酶SyGDH基因进行密码子优化,构建不同的共表达质粒,并分别导入宿主E.coliBL21（DE3）中,构建不同的重组菌YB-1～YB-10,以重组菌作为全细胞催化剂,在底物（对羟基亚苄基丙酮）浓度为10 g·L-1,辅底物（葡萄糖）浓度为9 g·L-1的条件下进行催化反应,其中YB-9（E.coli BL21/p RSF-sygdh-rirzs1）产覆盆子酮浓度最高,达到3.15 g·L-1。（2）优化重组菌YB-9合成覆盆子酮的工艺条件。单因素实验得出:YB-9的培养诱导条件为:当OD600为0.6-0.9时,加入终浓度为0.8 mmol·L-1的诱导剂IPTG,20℃,220 r·min-1的摇床中培养至OD600为14左右时离心收集细胞。全细胞催化的反应条件为:菌体用量5%（m/v,dcw）,底物与辅底物摩尔比为1:2.5,含5 mmol·L-1金属离子Mg2+的p H 5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,40℃反应2-3 h。其中,当底物为10 g·L-1,辅底物为27 g·L-1时,覆盆子酮浓度最高达到9.89 g·L-1,转化率为97.6%,时空转化效率为4.94 g·（L·h）-1。（3）对催化反应的产物进行提取鉴定。底物完全转化的反应液离心去除细胞后,上清液用乙酸乙酯萃取,40℃真空浓缩,并用水重结晶,得到的晶体经HPLC测定其纯度达到95%,经核磁共振氢谱鉴定,确定提取物为覆盆子酮。（4）对底物对羟基亚苄基丙酮的生物合成进行初步研究。过表达大肠杆菌来源的醛缩酶基因deo C,构建重组大肠杆菌YB-11（E.coli BL21/p RSF-deo C-rirzs1）,在添加底物对羟基苯甲醛和丙酮的TB培养基中发酵,可检测到42 mg·L-1覆盆子酮生成。此外,在利用黑曲霉（Aspergillus niger）来源的脂肪酶A为催化剂以对羟基苯甲醛和丙酮为底物,在水相体系40℃下脂肪酶催化反应可获得75.96 mg·L-1对羟基亚苄基丙酮,而在正丙醇/水体系中获得了589 mg·L-1对羟基亚苄基丙酮。说明底物对羟基亚苄基丙酮可以用生物法合成。上述研究结果为利用生物法合成覆盆子酮开辟了新的途径。
魏春茹[4]（2021）在《四个Kelch类型F-box基因TaFBK在小麦响应逆境胁迫中的功能研究》文中进行了进一步梳理F-box/Kelch（FBK）亚家族成员的数量在小麦（Triticum aestivum）F-box家族中位列第四,也是其他植物F-box家族中较大的亚家族之一。本实验室前期已对小麦F-box家族进行了系统地分类鉴定,并获得了58个TaFBK成员。随着2017年小麦参考基因组数据库（IWGSC v1.0）的公布,是不是会有更多Kelch类型的F-box蛋白注释出来呢?据报道,FBK亚家族成员能够增强拟南芥对线虫的感病性,并参与了苯丙氨酸解氨酶（PAL,phenylalanine ammonia-lyase）降解和多酚水平的调控,以及光的形态建成和开花时间的调控。Kelch类型的F-box蛋白是否响应非生物逆境胁迫,在小麦抵御叶锈菌侵染过程中是否发挥作用,具体作用机制如何呢?为回答这些问题,本论文拟选用更多的种子序列对IWGSC v1.0数据库进行全面检索。根据检索和分析的结果,进一步选取不同类型的FBK基因为研究对象,从基因序列获得、序列特性分析、生物/非生物胁迫处理下的表达模式、转基因功能验证、互作蛋白筛选和验证等方面展开研究。取得的主要结果如下:1、以IWGSC v1.0为检索对象,选用2个F-box、2个F-box-like和6个Kelch共10个种子序列进行小麦FBK（TaFBK）亚家族成员的查找和鉴定。共筛选到68个TaFBK基因,编码74个TaFBK蛋白;预测TaFBK蛋白主要定位于细胞核和细胞质中;其中F-box和Kelch结构域的保守性均较差,对比之下,Kelch结构域中氨基酸的保守性更低;TaFBK蛋白可分成5种结构域类型和7个进化分支,Kelch结构域的数量是FBK亚家族分类的主要标准;68个TaFBK基因不均匀地分布在小麦20条染色体上（2B染色体除外）,片段重复为其主要扩张方式;基于FPKM（Fragments per kilobase per million mapped reads）值的表达模式显示,TaFBK亚家族基因的表达呈组织特异性,且参与了小麦对干旱、热和干旱+热等胁迫的响应过程,相比之下，热胁迫所引起的小麦TaFBK基因的表达变化更为强烈。2、自小麦TcLr15获得了四个不同结构域组成的TaFBK基因完整编码区。进化关系分析表明,四个基因所编码的蛋白序列均与粗山羊草和二穗短柄草等小麦近缘种属中的同源蛋白呈现较高的序列一致性,与双子叶植物和木本植物的进化距离较远。qRT-PCR结果表明,TaFBK50和TaFBK34在小麦旗叶中呈高丰度表达,TaFBK71在雌蕊和幼叶中表达量相对较高。TaFBK19在小麦幼叶中的转录本累积较多,说明四个TaFBK基表达具有组织专化性;受不同毒力叶锈菌侵染后,四个TaFBK基因呈现不同程度、不同模式的表达。TaFBK19和TaFBK34受叶锈菌侵染后,转录本变化较大。在接种叶锈菌株05-5-137③（亲和组合）后96 h时,TcLr15中TaFBK19的表达量迅速升高,显着高于非亲和组合和未接种对照。TaFBK34在接种叶锈菌株05-19-43 ②（非亲和组合）后24 h时,表达量增至0h对照和亲和组合的3.6倍左右;各基因响应不同激素处理后表达模式各异,TaFBK19、TaFBK50和TaFKB34受三种激素的影响较大,而TaFBK71受其影响变化幅度较小:NaCl处理对小麦中四个基因表达量的影响均大于PEG 6000处理,尤其可引起TaFBK19和TaFBK34表达量的大幅度改变。荧光观察发现四个TaFBK蛋白均定位在细胞核和/或细胞质中。3、获得了三个表达量高于野生型三倍以上的超表达TaFBK34的小麦株系。表型观察发现,与野生型相比,超表达株系使三叶期小麦具有更好的耐盐性,且于300 mM NaCl处理48 h时,在所验证的两个超表达株系中TaPOD和TaAPX的表达量均显着高于野生型。但受盐胁迫后超表达株系的种子萌发率并未显着提高。应对叶锈菌和PEG 6000模拟的干旱,超表达和野生型株系间亦无明显表型差异。4、酵母双杂交（Yeast two-hybrid,Y2H）、双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC）和免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）三项技术证实 TaFBK19 可与小麦中的 Skp1/ASK1-like protein（TaSkp1）、TaPAL 和ADP-ribosylation factor 2-like isoform X1（TaARL2）相互作用,TaFBK34 可与 TaPAL和TaARL2发生相互作用。而且TaFBK19通过F-box结构域与TaSkp1相结合,TaFBK19和TaFBK34与TaARL2和TaPAL互作的区域均为Kelch结构域。TaFBK50只有在 Y2H 验证下表现为与 SEC1 family transport protein SLY1（TaSLYl）、TaSkp1和Chitinase 2（TaChi）蛋白发生相互作用,BiFC验证下均无互作;TaFBK71在Y2H及BiFC两种技术的验证下均与Skp1和SLY1互作。本研究结果为揭示Kelch类型的F-box蛋白是否在小麦遭遇盐和干旱等非生物逆境胁迫及叶锈菌侵染过程中发挥作用以及可能通过何种互作网络发挥功能提供了部分实验证据,为拓宽人们对FBK亚家族基因在小麦中的功能认识提供了重要参考。
翟君叶,成旭,孙泽敏,李春,吕波[5]（2021）在《毛蕊花糖苷的生物合成研究进展》文中研究说明毛蕊花糖苷是由咖啡酸、羟基酪醇、葡萄糖和鼠李糖组成的苯乙醇苷类衍生物,广泛存在于多种天然药用植物中,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、镇痛、神经保护、改善性功能、免疫调节和改善细胞记忆等多方面的生物活性。然而,植物提取来源的毛蕊花糖苷存在含量低、环境污染问题,无法实现绿色可持续的规模化生产。利用合成生物学成功构建了一系列植物天然产物的微生物细胞工厂,为高效生产毛蕊花糖苷提供了新思路。综述了毛蕊花糖苷细胞工厂的研究现状,包括苯乙醇苷生物合成关键代谢途径解析、关键基因元件挖掘和优化、关键前体物的合成等方面,以期为毛蕊花糖苷的生物合成奠定基础。
高松[6]（2020）在《代谢工程改造酿酒酵母从头合成黄杉素》文中研究指明黄杉素（Taxifolin）是一种提取自落叶松或者花旗松中的黄酮类植物天然产物,是黄酮木质素和花青素等多种植物天然产物的重要前体之一,同时对人体也具有多种保健功效。包括黄杉素在内的多种黄酮类化合物一般只能通过植物提取法获得,但植物提取法高度受到植物生长周期和季节性等影响,因此限制了相关化合物的广泛应用。而微生物法合成这些化合物具有多重优势,如反应条件温和、可利用廉价碳源和具有手性催化特异性等,因而受到广泛关注。基于此,本研究以酿酒酵母为底盘微生物,系统探究了微生物法高效合成黄杉素及其重要中间产物的强化策略。以从头设计原则、模块化策略、启动子工程策略和定向进化策略为基础,结合生物信息学和高通量筛选技术等手段,逐步验证和消除了在酿酒酵母中合成黄杉素的限制因素,实现了黄杉素及其重要中间产物对香豆酸、柚皮素和圣草酚在酿酒酵母中高效从头合成。本研究中使用的策略和建立的工具对其他天然产物相关基因的挖掘、表达和优化也具有重要借鉴意义。本论文的主要研究内容及结果如下:（1）从头合成柚皮素菌株的构建与柚皮素合成限制因素的鉴定。柚皮素是黄杉素合成的重要前体,因此首先构建了一株从头合成柚皮素的酿酒酵母菌株,并鉴定出柚皮素合成过程中的限制因素。通过在酿酒酵母基因组上整合Flavobacterium johnsoniae的酪氨酸解氨酶（FjTAL）、Petroselinum crispum的4-香豆酰辅酶A连接酶（Pc4CL）、Petunia X hybrida的查耳酮合酶（PhCHS）和Medicago sativa的查尔酮异构酶（MsCHI）,获得了一株可以从头合成柚皮素的工程菌株。通过诊断表达相关基因,验证了莽草酸途径代谢通量低和PhCHS酶活低是限制柚皮素合成的两个重要限速因素。通过发酵优化最终的工程菌株可以从2.50 g·L-1对香豆酸合成648.63 mg·L-1的柚皮素。（2）利用梯度强度启动子优化柚皮素合成基因的表达水平。途径优化是调节菌体代谢通路的重要手段,异源基因在宿主中表达往往会导致宿主代谢不平衡、中间代谢产物积累从而导致终产物产量较低。为了在酿酒酵母中优化柚皮素合成基因表达水平,首先根据RNA-Seq数据库初步筛选了66个启动子。用所选启动子表达荧光蛋白,利用流式细胞荧光分选技术（FACS）精确测定对应菌株的荧光强度,从而确定启动子的表达强度,同时通过实时荧光定量PCR确定启动子的转录强度。从启动子文库中选择30个梯度强度的启动子,分别与柚皮素合成途径基因Pc4CL、PhCHS和MsCHI随机组装,随后通过高通量筛选方法获得最佳菌株,经过发酵优化,改造菌株的柚皮素产量提高到1.21g·L-1,为首次获得克级别的柚皮素积累。（3）基于启动子工程和定向进化技术强化圣草酚合成。圣草酚作为黄杉素的直接前体,可以由柚皮素经过黄酮3′-羟化酶（F3′H）)催化获得。但是作为P450酶的F3′H和P450还原酶CPR的催化机制并不清楚,因此在应用于催化柚皮素合成圣草酚时受到限制。在本研究中,从水飞蓟中鉴定出一个全新的高效SmF3′H和与之匹配的SmCPR,并通过启动子工程优化了SmF3′H和SmCPR的表达水平后,圣草酚的产量显着提高。同时为进一步提高催化效率,通过定向进化技术筛选获得了SmF3′H和SmCPR的高效突变体SmF3′HD284N和SmCPRI453V,并且在本研究中建立了一种圣草酚的高通量检测方法,成功应用于启动子优化实验和定向进化实验中高通量筛选。经过发酵优化,最佳菌株可以从5.00 g·L-1的柚皮素高效合成3.28 g·L-1的圣草酚,是目前已报道的最高产量。（4）水飞蓟来源黄酮3-羟化酶的鉴定实现黄杉素的高效合成。圣草酚经过黄酮3-羟化酶（F3H）的催化获得黄杉素。一直以来,由于圣草酚产量低、F3H催化效率低等因素,微生物法合成黄杉素的产量也一直处在较低水平。本研究从水飞蓟转录组中鉴定得到一个高效黄酮3-羟化酶SmF3H。发酵验证结果表明,SmF3H具有黄酮3位羟基化功能,且催化效率显着高于常用的来源于Solanum lycopersicum的Sl F3H。随后选取6个转录强度不同的启动子优化SmF3H的表达水平,发现PGAL7启动子起始转录SmF3H时黄杉素合成产量最高,在摇瓶中产量达到695.90 mg·L-1;经过发酵优化,最佳菌株可以高效合成3.54 g·L-1黄杉素,是目前已报道的最高产量。（5）构建高拷贝整合工具包并应用于黄杉素从头合成菌株的构建。在酿酒酵母中从头合成黄杉素需要表达至少七个外源基因及三个莽草酸途径相关的基因,而质粒表达系统并不稳定,因而建立基于酿酒酵母的多基因、多位点、整合型表达的工具包非常有必要。因此,本研究构建了一个用于酿酒酵母基因组高拷贝整合的工具包,可以实现上述需求。该工具包将5种酿酒酵母转座子Ty（Ty retrotransposons）整合位点与10种筛选标签组合,获得包括五十种组合的质粒表达包,然后通过荧光蛋白鉴定每种组合在基因组上整合能力和重组子表达强度的分布情况。最后将黄杉素合成的相关基因整合在三个不同的Ty位点,获得了一株从头合成黄杉素的菌株。经过在发酵罐水平进行发酵优化,可以从葡萄糖合成135.83 mg·L-1的黄杉素。
赵莹[7]（2019）在《代谢工程大肠杆菌合成白藜芦醇》文中进行了进一步梳理白藜芦醇（Resveratrol）,是一种植物源天然产物,具有抗氧化、抗炎、保护心血管等活性,还可以延长小鼠、线虫等寿命。白藜芦醇已被广泛地应用于食品添加剂、保健品、化妆品当中。目前白藜芦醇主要从葡萄或虎杖中提取,但受植物生长的时间和空间限制。随着代谢工程和合成生物学的发展,利用工程微生物合成白藜芦醇已取得较大进展,但目前主要集中于以静态调控的方式改造白藜芦醇的合成途径。本文从加强前体丙二酰辅酶A的供给、组合优化白藜芦醇合成途径和大肠杆菌胞内环境、动态调控白藜芦醇合成等方面进行研究,主要结果如下。以对香豆酸为底物,对丙二酰辅酶A代谢途径进行调控,过表达anti-fabD sRNA降低丙二酰辅酶A至脂肪酸的消耗,过表达Cgacc基因增强从乙酰辅酶A至丙二酰辅酶A的合成。将这两方面结合,丙二酰辅酶A的含量提升了4.3倍,达0.35 nmol/mg DCW;白藜芦醇产量提升了1.7倍,达202.92 mg/L。以L-酪氨酸为底物,将PcTAL、At4CL和VvSTS利用不同拷贝数载体进行模块化组合,结果表明将PcTAL-At4CL置于高拷贝数载体,将VvSTS置于低拷贝数载体时有利于白藜芦醇合成。过表达10种外排基因（mdfA、emrD、emrE、acrAB、tolC、marA、yddG、araE、ompW和ompF）,结果表明过表达六种外排蛋白基因（acrAB、marA、yddG、araE、ompW和ompF）能提升白藜芦醇产量,其中过表达ompF基因效果最显着,使白藜芦醇产量提升了99.8%。通过过表达分子伴侣和omp F优化的大肠杆菌胞内环境,与优化的白藜芦醇合成途径相结合,白藜芦醇产量较出发菌株提升了3.1倍,达238.71 mg/L。将上述优化模块导入高产L-酪氨酸底盘菌株中,以甘油为碳源,白藜芦醇产量为332.24 mg/L。Wu等以葡萄糖为碳源,可合成304.5 mg/L白藜芦醇,本研究白藜芦醇产量较其提升了9.1%。使用转录因子FapR,设计不同启动子,构建了响应丙二酰辅酶A的动态调控系统,使丙二酰辅酶A的含量呈现震荡模式。相较于出发菌株,动态调控系统使白藜芦醇产量提升了1.6倍,达113.91 mg/L。代谢通量分析结果表明静态和动态系统均可以有效提升丙二酰辅酶A的供给和白藜芦醇的生成,但较静态系统,动态系统中白藜芦醇的合成代谢通量提升了51.4%,表明动态系统更高效。
杨芳芳[8]（2019）在《重组人和果蝇乙酰胆碱酯酶在毕赤酵母中分泌表达及对农药敏感性评估》文中进行了进一步梳理背景:对于有机磷和氨基甲酸酯类农药的农残快速检测,酶抑制法是当前国内外研究最多的,也是最简便、灵敏、经济、快速的一种检测方法。其中乙酰胆碱酯酶（acetylcho 1 inesterase,AChE）的活性受到有机磷和氨基甲酸酯类农药的特异性抑制,故而成为监控有机磷和氨基甲酸酯类农药的靶酶。本文基于Schulze等人对目前已被研究的乙酰胆碱酯酶酶源进行比较分析的结果,发现市面上常见的农药对人和果蝇乙酰胆碱酯酶的双分子速率常数较其他酶源要高很多,证明人和果蝇的乙酰胆碱酯酶酶源对农药更敏感,因此本实验采用人和果蝇来源的乙酰胆碱酯酶作为本实验研究对象。目前,乙酰胆碱酯酶主要从昆虫组织或者动物血液中提取,存在产量低、成本高且分离纯化困难,最重要是灵敏度差异比较大,因此寻找一种低成本高效的生产系统显得尤为重要。毕赤酵母表达系统表达的蛋白一般都具有蛋白活性,而且具有高密度发酵、原料成本低廉、基因遗传稳定性高、表达效率高等特点,最关键的是可以实现分泌表达和翻译后加工修饰,可以满足工业化大量生产乙酰胆碱酯酶的需求。目前该系统已经得到了大量推广和应用。目的:本实验利用毕赤酵母分泌表达系统分别对来自人和果蝇的乙酰胆碱酯酶基因进行分泌表达,并初步评估了其对市面上常见8种农药的敏感性大小。初步对这两个来源的乙酰胆碱酯酶进行实验室水平的探索研究,为工业化大规模生产高敏感性乙酰胆碱酯酶奠定基础。方法:本文为了实现人和果蝇乙酰胆碱酯酶基因在毕赤酵母中的分泌表达,根据Genbank上已发表的人和果蝇乙酰胆碱酯酶基因的核酸序列分别设计引物F1/R1和F2/R2,采用高保真PCR和RT-PCR技术分别扩增出hAChE和dmAChE的开放阅读框（ORF）片段,选取毕赤酵母表达载体pPIC9K,利用SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ双酶切分别将其克隆至载体pPIC9K中构建成重组质粒,重组质粒经菌落PCR和双酶切验证并测序分析后,经Sal Ⅰ酶分别线性化后电穿孔将其转化至毕赤酵母GS115中。采用MD平板筛选HIS+阳性转化子,并用含有G418抗性梯度的YPD平板进行多拷贝菌株筛选,菌落PCR进行阳性验证,最终分别在4.0 mg/mL G418 YPD抗性平板上筛选到人和果蝇AChE 阳性多拷贝酵母表达菌株,采用通用引物进行Mut表型验证,结果表明 GS11 5/PPIC9K-hAChE 为 Muts 型,GS115/pPIC9K-dmAChE为Mut+型,对重组酵母菌株分别进行0.5%甲醇诱导表达,利用Q-sepharose FF柱层析法对发酵表达产物进行纯化,获得了较纯的乙酰胆碱酯酶。对发酵表达产物进行SDS-PAGE蛋白凝胶图谱分析,并应用改良的Ellman法对发酵表达产物进行酶活测定和Bradford法进行蛋白含量测定。本文还通过初步计算比对GS115/pPIC9K-hAChE和GS115/pPIC9K-dmAChE重组工程菌发酵上清液对乐果、敌敌畏、甲胺磷、敌百虫、马拉硫磷、甲萘威、毒死蜱、克百威的IC50,最终进行酶源敏感性效度评估。结果:GS115/pPIC9K-hAChE在65 kDa处有一条明显蛋白条带,大小与预期hAChE蛋白一致。且hAChE蛋白质含量为1.33 mg/mL,含量占总蛋白的5.58%。最高比酶活达到1080 U/mL。GS115/pPIC9K-dmAChE在67 kDa处有一条明显蛋白条带,大小与预期dmAChE蛋白一致。且dmAChE蛋白质含量为2.52mg/mL,含量占总蛋白的10.58%。dmAChE蛋白最高比酶活达到 1914 U/mL。得出GS115/pPIC9K-hAChE对8种农药IC50结果如下:敌百虫>敌敌畏>克百威>马拉硫磷>乐果>甲胺磷>甲萘威>毒死蜱即人乙酰胆碱酯酶对毒死蜱最敏感。得出GS115/pPIC9K-dmAChE对8种农药IC50结果如下:乐果>甲胺磷>克百威>马拉硫磷>敌敌畏>甲萘威>敌百虫>毒死蜱。即果蝇乙酰胆碱酯酶对毒死蜱最敏感。
周胜虎[9]（2018）在《基于静态与动态调控策略的柚皮素生物合成研究》文中指出柚皮素（naringenin）是一类存在于橘子皮等植物组织中的重要天然产物,具有众多重要的生理功能,在食品、药品和化妆品等领域均有重要应用。此外,柚皮素是一种黄酮骨架物质,可经过不同催化反应形成种类众多的具有更高附加值的黄酮类化合物。目前柚皮素的生产方式是以从橘子皮中萃取为主,这导致其价格昂贵,且无法满足市场需求。本文利用静态调控、动态调控和定向进化相结合的手段,针对柚皮素异源合成途径、脂肪酸代谢途径和乙酰-CoA来源途径进行系统优化,建立了多基因代谢途径高通量静态调控方法、不同规模的高通量筛选方法和双动态调控系统,并提出了多系统定向进化理论,实现了柚皮素合成途径的再平衡和双动态调控系统偶联发酵。研究结果为其他类似的多基因代谢途径目标产物合成提供理论与技术参考。主要研究结果如下:（1）梯度强度大肠杆菌启动子-5’UTR复合体筛选与改造。多基因代谢途径调控需要大量不同强度的启动子。基于转录组测序、RegulonDB数据库分析、mRNA和蛋白质表达水平定量分析,筛选出了104种梯度强度启动子-5’UTR复合体（PUTR）。相比较于10mM阿拉伯糖诱导的PUTRBAD(PBAD启动子-5’UTR复合体),所筛选PUTR转录水平和翻译水平跨度分别为0.007%-4630%和0.1%-137%。为获得更高强度PUTR,通过组合不同强度的启动子区域和5’UTR区域构建得到了一系列组合PUTR,通过直接串联不同转录和翻译强度的PUTR构建得到了一系列串联PUTR。其中两个组合PUTR(PssrA-UTRrpsT和PdnaKJ-UTRrpsT)和两个串联PUTR(PUTRssrA-PUTRinfC-rplT和PUTRalsRBACE-PUTRinfC-rplT)具有最高表达强度,蛋白质表达水平分别为PUTRBAD的170%、137%、409%和203%。（2）柚皮素高产菌株的高通量筛选方法建立。代谢工程改造与定向进化策略相结合通常可以更好更快的实现目标。然而,依赖高效液相色谱（HPLC）的柚皮素检测方法无法实现高通量检测。基于金属离子与黄酮类化合物反应原理,通过对不同金属离子与柚皮素反应的优化和比较,建立了基于AlCl3和Mg（Ac）2与柚皮素反应的多孔板规模紫外光谱（373 nm）和荧光光谱（382 nm/505 nm和371 nm/492 nm）高通量检测方法。此外,以柚皮素响应蛋白TtgR为基础,建立了基于流式细胞仪的高通量筛选方法,利用远红色荧光蛋白标准化细胞体积和质粒拷贝数,最终柚皮素菌株的筛选通量可涵盖103-107/d范围,适用于绝大多数规模代谢工程改造菌株的快速筛选。（3）迭代高通量代谢流平衡策略优化柚皮素合成途径。多基因代谢途径的优化始终面临的挑战是难以同时对每一个基因进行多个水平的优化。为解决这一挑战,利用一系列所筛选的梯度强度PUTR建立不同表达规模的PUTR文库,并随机引入柚皮素合成途径基因上游,建立了多基因代谢途径随机优化文库。所有文库构建效率均高于83%,PUTR在文库中的重现率均高于60%。利用基于多孔板的高通量筛选方法,经过多轮迭代筛选和PUTR文库优化,最终获得柚皮素高产菌株,产量达192 mg·L-1,对香豆酸积累量为29 mg·L-1。在此基础上,进一步发现查尔酮合酶是柚皮素合成的限速步骤。（4）双动态调控系统强化丙二酰-CoA合成。已有大量报道表明丙二酰-CoA供给不足是柚皮素低产的重要原因。利用柚皮素和对香豆酸响应蛋白FdeR和PadR分别建立了针对丙二酰-CoA去路和来源代谢途径的动态调控系统,初步实现了菌体生长、柚皮素合成和对香豆酸的积累之间的平衡。为进一步协调细胞生长与产物合成之间的关系,分别优化了脂肪酸合成途径和丙二酰-CoA来源代谢途径,丙二酰-CoA产量提高7.4倍。经过优化后的丙二酰-CoA去路和来源动态调控系统分别将柚皮素产量提高3.2倍和1.5倍。与无动态调控系统相比,组合双动态调控系统菌株柚皮素产量提高3.8倍,达到139mg·L-1。（5）定向进化策略优化偶联丙二酰-CoA来源和去路双动态调控系统。人工构建的多个调控系统在同一微生物体系中的表达往往无法相互协调。为偶联丙二酰-CoA来源和去路的双动态调控系统,利用定向进化策略分别优化FdeR和PadR蛋白的表达,以实现双动态调控系统对于柚皮素和对香豆酸的响应强度调节,达到相互偶联的目的。经过易错PCR和流式细胞仪规模的高通量筛选,柚皮素产量达到251 mg·L-1,较未定向进化的菌株提高了1.8倍。随后进行了发酵温度、初始pH、碳源和氮源等因素的优化,最终微型反应器和摇瓶补料分批发酵优化后柚皮素的产量达到282 mg·L-1。
崔立立[10]（2014）在《磁性杂体交联酶聚集体的制备及酶学特性的研究》文中研究说明磁性纳米材料是近年来备受关注的一种绿色材料，其超大的比表面积，磁效应等特性使得磁性纳米材料作为酶固定化的载体具有很多优势。许多学者对表面进行活性基团修饰的磁性载体固定化酶进行了研究，但是对表面无活性基团修饰的磁性载体固定化酶的研究报道却很少。因此，本研究使用表面无活性基团修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒作为载体，结合交联酶聚体技术对酶固定化做了研究，成功制备出磁性杂体交联酶聚体（HM-CLEAs）。通过以粘红酵母苯丙氨酸解氨酶（PAL）和假丝酵母属脂肪酶（CSL）为模型酶，分别制备出了磁性杂体苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体（HM-PAL-CLEAs）及磁性杂体脂肪酶交联酶聚体（HM-CSL-CLEAs），优化了HM-PAL-CLEAs及HM-CSL-CLEAs的制备条件，并对其酶学特性进行了研究。1) Fe3O4磁性纳米颗粒的制备及表征使用共沉淀法制备了Fe3O4磁性纳米颗粒，并使用冷场扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射仪（XRD）、红外光谱仪（FTIR）、震动样品磁强计（VSM）对Fe3O4纳米颗粒进行了表征。结果表明，磁性纳米颗粒形态为比较规则的球形，颗粒大小均一，粒径大致为30nm，且分散比较均匀；饱和磁化强度为70.865emu/g，具有较高的饱和磁化强度；XRD及FTIR图表明磁性纳米颗粒为Fe3O4晶体。2) HM-PAL-CLEAs的制备及酶学特性的研究使用响应面设计确定了HM-PAL-CLEAs的最优制备条件，并考察了HM-PAL-CLEAs的酶学特性。结果表明，HM-PAL-CLEAs的最优制备条件为：磁性纳米颗粒浓度33.45mg/ml，酶浓度2.10mg/ml，（NH4）2SO4饱和度55%，戊二醛浓度0.05%。在优化条件下制备的HM-PAL-CLEAs的酶活回收率为42%。与游离酶相比， HM-PAL-CLEAs的pH稳定性、变性剂稳定性、储存稳定性和重复使用性显着提高。3) HM-CSL-CLEAs的制备及酶学特性的研究使用中心复合响应面和单因素实验优化了HM-CSL-CLEAs制备的条件，并对HM-CSL-CLEAs的磁响应性及酶学性质进行了研究。HM-CSL-CLEAs的最优制备条件为：磁性纳米颗粒浓度35mg/ml，酶浓度1.82mg/ml，（NH4）2SO4浓度2.41mol/L，戊二醛浓度0.21%。在优化条件下制备的HM-CSL-CLEAs的酶活回收率为40%，蛋白回收率为62%。与游离酶相比，HM-CSL-CLEAs的最适pH及温度发生了改变，热稳定性及储存稳定性明显提高。
二、基于苯丙氨酸解氨酶的生物传感器线性化研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基于苯丙氨酸解氨酶的生物传感器线性化研究（论文提纲范文）
（1）代谢工程改造酿酒酵母生产β-苯乙醇（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.1.1 β-苯乙醇概述 |
| 1.1.2 β-苯乙醇的规模化合成 |
| 1.1.3 酵母合成β-苯乙醇 |
| 1.2 酿酒酵母的莽草酸途径及其调控机制 |
| 1.2.1 莽草酸合成途径及其调节 |
| 1.2.2 β-苯乙醇合成途径及相关调控 |
| 1.2.3 利用莽草酸途径合成芳香族化合物 |
| 1.3 酿酒酵母的艾氏合成途径及其调控机制 |
| 1.3.1 可逆的L-苯丙氨酸转氨酶 |
| 1.3.2 酿酒酵母的苯丙酮酸脱羧酶家族及其相互作用 |
| 1.3.3 艾氏途径的脱氢反应 |
| 1.3.4 艾氏途径相关的其它重要反应 |
| 1.3.5 利用艾氏途径产β-苯乙醇 |
| 1.4 β-苯乙醇对酿酒酵母的抑制作用与应对策略 |
| 1.5 本论文主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据和研究意义 |
| 1.5.2 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 以葡萄糖为前体合成芳香醇的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 培养基与培养条件 |
| 2.2.3 实验仪器与药品 |
| 2.2.4 分子生物学操作 |
| 2.2.5 酶活力与NADP~+/NADPH测定方法 |
| 2.2.6 分析方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 莽草酸途径中反馈抑制的解除 |
| 2.3.2 酿酒酵母五功能酶Aro1 催化反应的分步分析 |
| 2.3.3 芳香醇合成支路的弱化与脱羧酶的表达 |
| 2.3.4 改善莽草酸途径前体PEP和E4P的供应 |
| 2.3.5 基于莽草酸途径的芳香醇合成策略的初步优化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 以L-苯丙氨酸为前体合成β-苯乙醇的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 培养基与培养条件 |
| 3.2.3 实验仪器与药品 |
| 3.2.4 分子生物学操作 |
| 3.2.5 基因表达水平验证 |
| 3.2.6 分析方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 酿酒酵母合成β-苯乙醇培养条件的初步优化 |
| 3.3.2 L-苯丙氨酸转氨酶的功能研究与筛选表达 |
| 3.3.3 不同来源苯丙酮酸脱羧酶的表达 |
| 3.3.4 艾氏途径相关酶在酿酒酵母中的融合表达 |
| 3.3.5 氨基受体的循环利用 |
| 3.3.6 丙酮酸脱羧酶基因PDC5 缺失促进β-苯乙醇的合成 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于转录组学分析基因PDC5 的缺失对酿酒酵母β-苯乙醇合成的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 培养基与培养条件 |
| 4.2.3 实验仪器与药品 |
| 4.2.4 酵母转录组测序及比较基因组学分析 |
| 4.2.5 基因表达水平测定 |
| 4.2.6 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 不同培养基中PDC5 的缺失对酿酒酵母合成β-苯乙醇的影响 |
| 4.3.2 基于转录组学解析PDC5 的缺失对β-苯乙醇合成的影响 |
| 4.3.3 突变株RM22 中促进β-苯乙醇合成的关键基因的挖掘与验证 |
| 4.3.4 突变株RM22 中促进β-苯乙醇合成的作用机制解析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 适应性进化高产β-苯乙醇突变株的比较基因组学分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 培养基 |
| 5.2.3 实验仪器与药品 |
| 5.2.4 适应性进化方法 |
| 5.2.5 酵母重测序及比较基因组学分析 |
| 5.2.6 关键基因过表达菌株的构建 |
| 5.2.7 分析方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 酿酒酵母耐β-苯乙醇适应性进化菌株的筛选 |
| 5.3.2 适应性进化菌株AD032 与对照菌株WT-A的重测序与比较基因组学分析 |
| 5.3.3 部分关键基因对酵母合成β-苯乙醇的影响 |
| 5.3.4 基于代谢调控改造的高产β-苯乙醇菌株的构建 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 异源途径基因优化后的序列 |
| 附录Ⅱ 本研究所用引物 |
| 附录Ⅲ 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（2）无细胞合成体系中丙二酸单酰辅酶A再生的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 丙二酰辅酶A |
| 1.1.1 丙二酸辅酶A的应用 |
| 1.1.2 丙二酰辅酶A的检测方法 |
| 1.1.3 丙二酰辅酶A的合成 |
| 1.1.4 参与丙二酰辅酶A合成的关键酶 |
| 1.2 柚皮素简介 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 1.4 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 仪器与设备 |
| 2.3 常用试剂的配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 酵母总RNA的提取 |
| 2.4.2 关键酶基因的克隆 |
| 2.4.3 蛋白质的表达与纯化 |
| 2.4.4 丙二酰辅酶A体外再生体系的初步建立 |
| 2.4.5 丙二酰辅酶A体外再生体系的优化 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 丙二酰辅酶A体外合成关键酶基因的克隆 |
| 3.1.1 ACS基因的克隆 |
| 3.1.2 ACC1的克隆 |
| 3.2 融合蛋白的表达 |
| 3.2.1 His-TrxA-ACS融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.2.2 His-ACC1融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.2.3 His-SUMO-4CC融合蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.3 丙二酰辅酶A体外再生体系的初步建立 |
| 3.4 体外反应体系的优化 |
| 3.4.1 pH的优化 |
| 3.4.2 反应时间的优化 |
| 3.4.3 反应温度的优化 |
| 3.4.4 底物浓度的优化 |
| 3.5 优化前后柚皮素产量的对比 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 展望 |
| 4.3 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）重组大肠杆菌全细胞合成覆盆子酮的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 覆盆子酮的简介 |
| 1.1.1 覆盆子酮的结构与性质 |
| 1.1.2 覆盆子酮的应用 |
| 1.2 覆盆子酮的生产方法 |
| 1.2.1 植物提取 |
| 1.2.2 覆盆子酮的化学合成 |
| 1.2.3 生物技术法合成覆盆子酮的研究进展 |
| 1.3 全细胞催化 |
| 1.3.1 全细胞催化的主要优势 |
| 1.3.2 全细胞催化中常用的辅酶再生系统 |
| 1.4 羟醛缩合反应制备底物对羟基亚苄基丙酮 |
| 1.4.1 Aldol反应的化学催化 |
| 1.4.2 Aldol反应的生物催化 |
| 1.5 本课题的研究背景,立题意义与研究内容 |
| 1.5.1 研究背景 |
| 1.5.2 立题意义 |
| 1.5.3 主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.1.4 主要培养基及主要溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的基因的获取 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 大肠杆菌基因组的提取 |
| 2.2.4 大肠杆菌超级感受态的制备及热激转化 |
| 2.2.5 目的基因的克隆 |
| 2.2.6 质粒的提取 |
| 2.2.7 重组质粒的构建 |
| 2.2.8 重组菌株的构建 |
| 2.2.9 细菌的培养、诱导表达及全细胞催化剂的制备 |
| 2.2.10 全细胞催化剂制备条件的优化 |
| 2.2.11 全细胞催化及催化条件的优化 |
| 2.2.12 产物覆盆子酮的分离与鉴定 |
| 2.2.13 底物对羟基亚苄基丙酮的初步合成 |
| 2.2.14 生物量检测 |
| 2.2.15 葡萄糖浓度检测 |
| 2.2.16 高效液相色谱分析 |
| 2.2.17 琼脂糖凝胶电泳和蛋白表达分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 重组菌株的构建及其产覆盆子酮能力的对比 |
| 3.1.1 重组菌株的构建 |
| 3.1.2 重组菌株产覆盆子酮能力的对比 |
| 3.2 YB-9的培养及诱导条件的优化 |
| 3.2.1 诱导时机的优化 |
| 3.2.2 诱导剂IPTG浓度的优化 |
| 3.2.3 诱导温度的优化 |
| 3.2.4 诱导时长的优化 |
| 3.3 YB-9的全细胞催化条件的优化 |
| 3.3.1 全细胞催化剂浓度(菌体量)的优化 |
| 3.3.2 底物浓度的优化 |
| 3.3.3 催化体系中底物与辅底物浓度比的优化 |
| 3.3.4 催化反应pH的优化 |
| 3.3.5 催化反应温度的优化 |
| 3.3.6 催化体系中金属离子和EDTA浓度的优化 |
| 3.4 优化条件后的覆盆子酮合成 |
| 3.4.1 摇瓶水平上最佳条件下覆盆子酮产量 |
| 3.4.2 放大至3L发酵罐后的最佳条件下覆盆子酮产量 |
| 3.5 覆盆子酮的初步分离和鉴定 |
| 3.5.1 覆盆子酮产品分离 |
| 3.5.2 覆盆子酮结晶的核磁共振氢谱鉴定 |
| 3.6 底物对羟基亚苄基丙酮的生物合成初步研究 |
| 3.6.1 过表达deoC基因发酵合成对羟基亚苄基丙酮 |
| 3.6.2 利用脂肪酶催化合成覆盆子酮前体对羟基亚苄基丙酮 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A:作者攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录B:补充材料 |
| 附录C:分析方法和标准曲线 |
（4）四个Kelch类型F-box基因TaFBK在小麦响应逆境胁迫中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 F-box家族蛋白的发现、结构特征、分类及数量 |
| 1.2 F-box蛋白的功能 |
| 1.2.1 F-box蛋白在植物生长发育中的功能 |
| 1.2.2 F-box蛋白在植物激素信号传导中的功能 |
| 1.2.3 F-box蛋白在植物抵御非生物逆境中的功能 |
| 1.2.4 F-box蛋白在植物抗病中的功能 |
| 1.3 小麦叶锈病 |
| 1.4 小麦中F-box家族的研究概况 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 小麦FBK亚家族成员鉴定与分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 小麦基因组中FBK亚家族成员的筛选和鉴定 |
| 2.1.2 小麦FBK蛋白保守结构域预测及分类 |
| 2.1.3 小麦FBK蛋白序列分析 |
| 2.1.4 小麦FBK蛋白进化树的构建及分析 |
| 2.1.5 小麦FBK基因染色体分布与基因重复分析 |
| 2.1.6 dPCR分析小麦FBK亚家族基因的表达谱 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 基因组范围筛选和鉴定小麦FBK亚家族成员 |
| 2.2.2 小麦FBK亚家族F-box和Kelch结构域中氨基酸保守性预测 |
| 2.2.3 小麦FBK蛋白的分类和进化关系分析 |
| 2.2.4 小麦FBK基因染色体上的分布及主要扩张方式分析 |
| 2.2.5 基于dPCR的小麦FBK亚家族基因的表达分析 |
| 2.3 小结 |
| 2.4 讨论 |
| 3 四个TaFBK基因的克隆与表达模式分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 小麦材料及叶锈菌菌株 |
| 3.1.2 菌株和质粒 |
| 3.1.3 主要试剂及配制方法 |
| 3.1.4 试验中所用引物 |
| 3.1.5 基因克隆与生物信息学分析 |
| 3.1.6 基因表达模式分析 |
| 3.1.7 亚细胞定位观察 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 四个TaFBK基因的获取及特性分析 |
| 3.2.2 四个TaFBK基因的组织专化性表达分析 |
| 3.2.3 四个TaFBK基因受叶锈菌侵染的表达分析 |
| 3.2.4 四个TaFBK基因受外源激素诱导的表达分析 |
| 3.2.5 四个TaFBK基因受盐和干旱胁迫的表达分析 |
| 3.2.6 四个TaFBK蛋白的亚细胞定位观察 |
| 3.3 小结 |
| 3.4 讨论 |
| 4 小麦中TaFBK34的功能研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂及配制方法 |
| 4.1.3 试验中所用引物 |
| 4.1.4 引物设计 |
| 4.1.5 载体构建 |
| 4.1.6 农杆菌转化试验 |
| 4.1.7 农杆菌转染小麦 |
| 4.1.8 阳性植株的检测 |
| 4.1.9 抗逆表型鉴定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 超表达TaFBK34基因的小麦家系获得 |
| 4.2.2 超表达TaFBK34小麦植株的表型鉴定 |
| 4.2.3 TaFBK34基因的RNAi小麦阳性植株获得 |
| 4.3 小结 |
| 4.4 讨论 |
| 5 与TaFBK成员互作的靶蛋白筛选及验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌株和质粒 |
| 5.1.2 主要试剂及配制方法 |
| 5.1.3 试验中所用引物 |
| 5.1.4 STRING软件预测 |
| 5.1.5 酵母双杂交(Y2H)文库构建及质量检测 |
| 5.1.6 诱饵载体的构建 |
| 5.1.7 Y2H文库筛选与四个TaFBK互作的蛋白 |
| 5.1.8 Y2H一对一回复验证 |
| 5.1.9 双分子荧光互补试验(BiFC)验证蛋白互作 |
| 5.1.10 免疫共沉淀试验(Co-IP)验证蛋白间互作 |
| 5.1.11 互作蛋白间具体互作功能结构域的验证 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 与四个TaFBK互作的靶蛋白预测 |
| 5.2.2 抗叶锈病性TcLr15小麦cDNA酵母文库的构建及质量检测 |
| 5.2.3 四个包含TaFBK基因的诱饵载体构建 |
| 5.2.4 四个TaFBK诱饵载体的毒性和自激活活性检测 |
| 5.2.5 Y2H文库筛选获得候选靶蛋白 |
| 5.2.6 一对一回复验证蛋白间互作 |
| 5.2.7 BiFC技术验证蛋白间的互作 |
| 5.2.8 Co-IP技术验证蛋白间的互作 |
| 5.2.9 TaFBK蛋白与靶蛋白互作的结构域验证 |
| 5.3 小结 |
| 5.4 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 1 小麦中的FBK蛋白 |
| 附表 2 拟南芥、水稻、高粱和玉米中的FBK蛋白 |
| 在读期间的成果 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）毛蕊花糖苷的生物合成研究进展（论文提纲范文）
| 1 毛蕊花糖苷生物合成途径解析 |
| 1.1 苯丙氨酸代谢途径 |
| 1.2 多巴胺途径/酪胺代谢途径 |
| 1.3 毛蕊花糖苷的酰基转移和糖基修饰交叉途径 |
| 2 毛蕊花糖苷合成的高效调控策略 |
| 2.1 毛蕊花糖苷合成相关转录组挖掘 |
| 2.2 毛蕊花糖苷合成和调控的关键酶挖掘 |
| 3 毛蕊花糖苷关键中间体的微生物合成 |
| 3.1 咖啡酸 |
| 3.2 羟基酪醇 |
| 3.3 酪醇和红景天苷 |
| 4 结论与展望 |
（6）代谢工程改造酿酒酵母从头合成黄杉素（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.1.1 植物天然产物与医药健康 |
| 1.1.2 黄酮类化合物简介 |
| 1.1.3 黄杉素及其微生物法合成 |
| 1.2 微生物法合成黄杉素的现状与趋势 |
| 1.2.1 对香豆酸合成途径及其强化策略 |
| 1.2.2 柚皮素合成途径及其强化策略 |
| 1.2.3 圣草酚/黄杉素合成途径及其强化策略 |
| 1.2.4 丙二酰辅酶A途径及其强化策略 |
| 1.3 立项依据和研究意义 |
| 1.4 主要研究内容 |
| 第二章 从头合成柚皮素及限速步骤鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株、基因、质粒和试剂 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 仪器设备 |
| 2.2.4 水飞蓟来源查尔酮合酶的获得 |
| 2.2.5 质粒和菌株的构建 |
| 2.2.6 菌株的构建 |
| 2.2.7 培养条件 |
| 2.2.8 分析与检测条件 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 柚皮素从头合成菌株的构建 |
| 2.3.2 莽草酸途径对柚皮素积累的影响 |
| 2.3.3 外源基因表达强度对柚皮素积累的影响 |
| 2.3.4 发酵罐水平优化柚皮素积累 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于启动子文库优化基因表达水平高效合成柚皮素 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株、基因、质粒和试剂 |
| 3.2.2 培养基 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 出发质粒和菌株的构建 |
| 3.2.5 RNA-Seq |
| 3.2.6 构建启动子文库 |
| 3.2.7 通过流式细胞仪鉴定启动子的翻译强度 |
| 3.2.8 通过RT-PCR检测启动子的转录强度 |
| 3.2.9 基于启动子库的柚皮素合成途径优化 |
| 3.2.10 高通量筛选方法 |
| 3.2.11 培养条件 |
| 3.2.12 分析与检测条件 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 从S288c扩增启动子序列 |
| 3.3.2 启动子转录和翻译强度的确定 |
| 3.3.3 启动子库相对翻译强度的确定 |
| 3.3.4 基于启动子文库的基因表达水平优化 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于启动子工程和定向进化策略高效合成圣草酚 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株、基因、质粒和试剂 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 仪器设备 |
| 4.2.4 预测Sm F3′H/SmCPR |
| 4.2.5 扩增和鉴定SmF3′H/SmCPR |
| 4.2.6 基于启动子的SmF3′H/SmCPR表达水平优化 |
| 4.2.7 SmF3′H和 SmCPR定向进化 |
| 4.2.8 培养条件 |
| 4.2.9 高通量检测方法 |
| 4.2.10 分析与检测条件 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 圣草酚高通量检测技术 |
| 4.3.2 Sm F3′H/SmCPR催化活性验证 |
| 4.3.3 Sm F3′H/SmCPR的基因表达水平优化 |
| 4.3.4 Sm F3′H/SmCPR的定向进化 |
| 4.3.5 最佳菌株生产圣草酚的发酵优化 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 高效黄酮3-羟化酶鉴定与黄杉素发酵优化 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂、菌种和质粒 |
| 5.2.2 培养基与缓冲液 |
| 5.2.3 仪器设备表 |
| 5.2.4 预测水飞蓟来源黄酮3-羟化酶 |
| 5.2.5 扩增SmF3H并构建SmF3H的表达菌株 |
| 5.2.6 基于启动子优化基因表达水平 |
| 5.2.7 培养条件 |
| 5.2.8 分析与检测方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 SmF3H的序列分析 |
| 5.3.2 SmF3H的功能鉴定 |
| 5.3.3 基于启动子优化SmF3H表达水平 |
| 5.3.4 在5-L发酵罐水平进行黄杉素发酵优化 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 构建从头合成黄杉素菌株 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试剂、菌种和质粒 |
| 6.2.2 培养基 |
| 6.2.3 仪器设备 |
| 6.2.4 酿酒酵母菌株的构建 |
| 6.2.5 构建Ty表达包 |
| 6.2.6 Ty表达包的整合能力验证 |
| 6.2.7 单位点Ty整合菌株构建 |
| 6.2.8 双位点Ty整合菌株构建 |
| 6.2.9 丙二酰辅酶A途径强化菌株的构建 |
| 6.2.10 三位点Ty整合菌株构建及拷贝数验证 |
| 6.2.11 培养条件 |
| 6.2.12 检测方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 Ty表达包整合能力的验证 |
| 6.3.2 单位点Ty整合菌株生产能力的鉴定 |
| 6.3.3 双位点Ty整合菌株生产能力的鉴定 |
| 6.3.4 丙二酰辅酶A途径对柚皮素和黄杉素积累的影响 |
| 6.3.5 三位点Ty整合菌株从头合成黄杉素能力 |
| 6.3.6 在5-L发酵罐中从头合成黄杉素 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 I:作者在攻读博士学位期间发表论文及专利申请 |
| 附录 II:引物与基因序列 |
| 附录 表1 第二章所用引物 |
| 附录 表2 第三章用于菌株构建和RT-PCR所用引物 |
| 附录 表3 第三章用于从S288c扩增启动子序列的引物 |
| 附录 表4 第三章用于组装EGFP表达框的引物 |
| 附录 表5 第三章中启动子荧光强度、转录强度和FPKM值 |
| 附录 表6 第三章用于途径基因优化的引物 |
| 附录 表7 第三章中启动子特性 |
| 附录 表8 第四章中所用引物 |
| 附录 表9 第五章中所用引物 |
| 附录 表10 第六章中所用引物 |
| 附录 表11 本论文涉及到基因的DNA序列 |
（7）代谢工程大肠杆菌合成白藜芦醇（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 白藜芦醇 |
| 1.1.1 白藜芦醇的结构和理化性质 |
| 1.1.2 白藜芦醇的生理活性 |
| 1.1.3 白藜芦醇的应用 |
| 1.2 微生物代谢工程合成白藜芦醇 |
| 1.2.1 酵母合成白藜芦醇 |
| 1.2.2 大肠杆菌合成白藜芦醇 |
| 1.3 动态调控代谢工程 |
| 1.3.1 动态调控系统用于基因筛选 |
| 1.3.2 动态调控系统用于产量优化 |
| 1.3.3 丙二酰辅酶A动态调控 |
| 1.4 本文的主要研究内容和意义 |
| 1.4.1 本文的主要研究内容 |
| 1.4.2 本文的研究意义 |
| 第2章 靶向丙二酰辅酶A代谢节点提升白藜芦醇产量 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验所用质粒 |
| 2.1.2 实验所用菌株 |
| 2.1.3 实验所用仪器 |
| 2.1.4 实验所用试剂 |
| 2.1.5 实验所用引物 |
| 2.1.6 实验所用培养基及培养方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒提取 |
| 2.2.2 质粒构建相关方法 |
| 2.2.3 质粒转化 |
| 2.2.4 RNA提取 |
| 2.2.5 RT-PCR |
| 2.2.6 RT-PCR电泳条带光密度定量 |
| 2.2.7 生物量和代谢物检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 初步优化对香豆酸合成白藜芦醇 |
| 2.3.2 抑制脂肪酸合成提升白藜芦醇产量 |
| 2.3.3 促进丙二酰辅酶A来源提升白藜芦醇产量 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 从头合成白藜芦醇的组合优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验所用质粒 |
| 3.1.2 实验所用菌株 |
| 3.1.3 实验所用仪器 |
| 3.1.4 实验所用试剂 |
| 3.1.5 实验所用引物 |
| 3.1.6 实验所用培养基及培养方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重叠延伸PCR |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 L-酪氨酸合成白藜芦醇模块的设计和构建 |
| 3.3.2 L-酪氨酸合成白藜芦醇模块化优化 |
| 3.3.3 筛选转运基因以提升白藜芦醇产量 |
| 3.3.4 L-酪氨酸合成白藜芦醇的组合优化 |
| 3.3.5 甘油合成白藜芦醇 |
| 3.3.6 白藜芦醇发酵动力学 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 动态调控丙二酰辅酶A代谢节点提升白藜芦醇产量 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验所用质粒 |
| 4.1.2 实验所用菌株 |
| 4.1.3 实验所用仪器 |
| 4.1.4 实验所用试剂 |
| 4.1.5 实验所用引物 |
| 4.1.6 实验所用培养基及培养方法 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 定量测定荧光 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 动态调控系统的设计 |
| 4.3.2 动态调控系统的验证 |
| 4.3.3 模块组合对白藜芦醇产量的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 白藜芦醇合成代谢通量分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验所用菌株 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 拟稳态模型的构建 |
| 5.2.2 代谢通量的计算 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 已有模型代谢通量分析 |
| 5.3.2 白藜芦醇合成代谢通量分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文及参加科研情况 |
| 致谢 |
（8）重组人和果蝇乙酰胆碱酯酶在毕赤酵母中分泌表达及对农药敏感性评估（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 农药残留现状 |
| 1.2.1 我国农药使用现状 |
| 1.2.2 农药残留现状 |
| 1.2.3 农药残留对人类的危害 |
| 1.3 农药残留主要检测技术 |
| 1.3.1 基于酶抑制法原理的速测法技术 |
| 1.3.2 色谱快速检测技术 |
| 1.3.3 酶联免疫技术 |
| 1.4 乙酰胆碱酯酶研究现状 |
| 1.4.1 乙酰胆碱酯酶的来源现状 |
| 1.4.2 乙酰胆碱酯酶敏感性现状 |
| 1.5 外源蛋白表达系统 |
| 1.5.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.5.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.5.3 杆状病毒表达系统 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒和菌株 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 hAChE基因在毕赤酵母中表达 |
| 2.2.1 hAChE基因克隆 |
| 2.2.2 表达载体pPIC9K-hAChE的构建、转化与筛选 |
| 2.2.3 重组酵母GS115/pPIC9K-hAChE的菌落PCR鉴定 |
| 2.2.4 重组酵母GS115/pPIC9K-hAChE的诱导表达 |
| 2.2.5 表达产物的纯化 |
| 2.3 dmAChE基因在毕赤酵母中表达 |
| 2.3.1 dmAChE基因克隆 |
| 2.3.2 表达载体pPIC9K-dmAChE的构建、转化与筛选 |
| 2.3.3 重组酵母GS115/pPIC9K-dmAChE的菌落PCR鉴定 |
| 2.3.4 重组酵母GS115/pPIC9K-dmAChE的诱导表达 |
| 2.3.5 表达产物的纯化 |
| 2.4 酶活测定 |
| 2.5 农药敏感性实验 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 hAChE基因在毕赤酵母中表达 |
| 3.1.1 AChE基因克隆 |
| 3.1.2 表达载体pPIC9K-hAChE的构建 |
| 3.1.3 表达载体pPIC9K-hAChE的转化与筛选 |
| 3.1.4 重组酵母GS115/pPIC9K-hAChE的菌落PCR鉴定 |
| 3.1.5 hAChE重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.1.6 hAChE对8种农药敏感性比较 |
| 3.2 dmAChE基因在毕赤酵母中表达 |
| 3.2.1 dmAChE基因克隆 |
| 3.2.2 表达载体pPIC9K-dmAChE的构建 |
| 3.2.3 表达载体pPIC9K-dmAChE的转化与筛选 |
| 3.2.4 重组酵母GS115/pPIC9K-dmAChE的菌落PCR鉴定 |
| 3.2.5 dmAChE重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.2.6 dmAChE对8种农药敏感性比较 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 毕赤酵母表达水平改进 |
| 4.1.1 基因剂量对表达量的影响 |
| 4.1.2 酵母自身分泌的蛋白酶对表达量的影响 |
| 4.1.3 密码子偏好性对表达量的影响 |
| 4.2 酶活测定条件优化 |
| 4.2.1 酶活测定条件单因素实验 |
| 4.2.2 正交试验法优化反应体系条件 |
| 4.3 酶的敏感性和表达量改进研究 |
| 4.3.1 敏感性改进 |
| 4.3.2 表达量改进 |
| 4.4 针对GS115/pPIC9K-dmAChE功能探索 |
| 4.5 结论及后续工作建议 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 农药残留现状 |
| 1.2.1 我国农药使用现状 |
| 1.2.2 农药残留现状 |
| 1.2.3 农药残留对人类的危害 |
| 1.3 农药残留主要的检测技术 |
| 1.3.1 几种常见的农药检测技术 |
| 1.3.2 酶抑制法检测技术原理 |
| 1.4 外源蛋白表达系统研究现状 |
| 1.4.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.4.3 杆状病毒表达系统 |
| 1.5 乙酰胆碱酯酶研究进展 |
| 1.5.1 国内外关于乙酰胆碱酯酶基因克隆和表达系统的研究现状 |
| 1.5.1.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 1.5.1.2 反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 1.5.1.3 定点突变技术 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
| 附录 |
（9）基于静态与动态调控策略的柚皮素生物合成研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.1.1 黄酮类化合物的价值功能 |
| 1.1.2 柚皮素的生产方法 |
| 1.1.3 柚皮素的合成途径 |
| 1.2 代谢工程改造微生物生产柚皮素及其衍生物 |
| 1.2.1 柚皮素合成途径模块化调控策略 |
| 1.2.2 丙二酰-CoA合成途径改造 |
| 1.2.3 高附加值柚皮素衍生物合成策略 |
| 1.3 动态调控策略合成小分子化合物 |
| 1.3.1 基于群体响应效应的动态调控策略 |
| 1.3.2 基于目标化合物反馈调节生物传感器的动态调控策略 |
| 1.4 立项依据和研究意义 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 1.5.1 大肠杆菌中合成柚皮素面临的挑战 |
| 1.5.2 本文主要研究内容 |
| 第二章 大肠杆菌梯度强度启动子-5'UTR的筛选与鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂、菌种和质粒 |
| 2.2.2 培养基与缓冲液 |
| 2.2.3 仪器设备 |
| 2.2.4 启动子的选择 |
| 2.2.5 整合位点选择 |
| 2.2.6 质粒构建 |
| 2.2.7 启动子工程构建高强度启动子 |
| 2.2.8 菌体培养和荧光测定 |
| 2.2.9 RT-qPCR分析启动子转录强度 |
| 2.2.10 β-半乳糖苷酶活性测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 PUTR文库筛选与准备 |
| 2.3.2 PUTR转录特性研究 |
| 2.3.3 细胞生长不同时期PUTR蛋白质表达特性研究 |
| 2.3.4 相同PUTR荧光蛋白表达与mRNA水平对比 |
| 2.3.5 启动子工程构建高强度PUTR |
| 2.3.6 工程化PUTR普适性研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于多孔板和流式细胞仪的柚皮素高产菌株高通量筛选 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂、菌株和质粒 |
| 3.2.2 培养条件 |
| 3.2.3 紫外光谱分析 |
| 3.2.4 荧光光谱分析 |
| 3.2.5 柚皮素检测条件优化 |
| 3.2.6 混合交叉实验检测底物干扰 |
| 3.2.7 HPLC检测 |
| 3.2.8 柚皮素生物传感器构建 |
| 3.2.9 柚皮素响应的生物传感器功能验证 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 柚皮素、对香豆酸和L-酪氨酸的紫外-可见光光波谱学特性 |
| 3.3.2 柚皮素、对香豆酸和L-酪氨酸的荧光光谱学特性 |
| 3.3.3 柚皮素检测条件优化 |
| 3.3.4 中间产物干扰性验证 |
| 3.3.5 TtgR对柚皮素浓度响应特性研究 |
| 3.3.6 基于TtgR的超高通量筛选方法 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 迭代高通量代谢流平衡策略优化柚皮素合成途径 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试剂、菌株和质粒 |
| 4.2.2 途径文库构建 |
| 4.2.3 柚皮素高产菌株的高通量筛选 |
| 4.2.4 HPLC检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 质粒文库多样性验证 |
| 4.3.2 柚皮素高产菌株第一轮高通量筛选 |
| 4.3.3 柚皮素高产菌株迭代高通量筛选 |
| 4.3.4 柚皮素合成关键代谢节点解析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 双动态调控系统强化丙二酰-CoA合成 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 柚皮素浓度响应传感器构建 |
| 5.2.3 对香豆酸浓度响应传感器构建 |
| 5.2.4 丙二酰-CoA去路代谢途径优化 |
| 5.2.5 柚皮素响应的放大器性能研究 |
| 5.2.6 丙二酰-CoA来源代谢途径调节 |
| 5.2.7 胞内丙二酰-CoA测定方法 |
| 5.2.8 RT-PCR测定mRNA含量 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 柚皮素响应启动子结构研究 |
| 5.3.2 对香豆酸响应启动子结构研究 |
| 5.3.3 柚皮素动态调控模块放大效应 |
| 5.3.4 脂肪酸代谢途径优化 |
| 5.3.5 丙二酰-CoA来源代谢途径优化 |
| 5.3.6 双动态调控系统组合发酵 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 定向进化策略优化动态调控途径代谢流 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株和质粒 |
| 6.2.2 柚皮素及对香豆酸响应模块文库构建 |
| 6.2.3 流式细胞仪分选 |
| 6.2.4 柚皮素高产菌株复筛及摇瓶发酵 |
| 6.2.5 柚皮素生产的发酵条件优化 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 文库构建与转化效率检测 |
| 6.3.2 高通量筛选柚皮素高产菌株 |
| 6.3.3 柚皮素高产菌株复筛及摇瓶发酵 |
| 6.3.4 发酵温度优化 |
| 6.3.5 发酵pH条件优化 |
| 6.3.6 发酵碳源和氮源优化 |
| 6.3.7 摇瓶和微型反应器补料分批发酵 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:作者在攻读博士学位期间发表论文及专利申请 |
| 附录 Ⅱ:所用引物和PUTR序列 |
| 附录2-1:第二章PUTR扩增所用引物 |
| 附录2-2:第二章所选PUTR序列信息 |
| 附录2-3:第二章PUTR转录水平和不同时期翻译水平 |
| 附录2-4:第四章所用引物 |
| 附录2-5:本研究所用基因序列 |
（10）磁性杂体交联酶聚集体的制备及酶学特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 固定化方法 |
| 1.2.1 吸附法 |
| 1.2.2 共价结合法 |
| 1.2.3 包埋法 |
| 1.2.4 交联法 |
| 1.2.5 定向固定化 |
| 1.2.6 无载体固定化 |
| 1.2.7 共固定化 |
| 1.3 用于酶固定化的纳米材料 |
| 1.3.1 介孔材料 |
| 1.3.2 纳米纤维 |
| 1.3.3 碳纳米管 |
| 1.3.4 纳米颗粒 |
| 1.4 磁性纳米颗粒 |
| 1.4.1 磁性纳米颗粒的分类 |
| 1.4.2 Fe_3O_4磁性纳米颗粒的制备 |
| 1.5 磁性材料与交联酶聚体技术结合在酶固定化的应用 |
| 1.6 苯丙氨酸解氨酶固定化研究进展 |
| 1.7 脂肪酶固定化研究进展 |
| 1.8 立题目的和意义 |
| 1.9 研究内容 |
| 第2章 磁性纳米颗粒的制备及表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 磁性纳米颗粒的 SEM 图 |
| 2.3.2 磁性纳米颗粒在磁铁作用下的沉降情况 |
| 2.3.3 磁性纳米颗粒的磁化曲线 |
| 2.3.4 磁性纳米颗粒的 FTIR |
| 2.3.5 磁性纳米颗粒的 XRD 图 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 磁性杂体苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备及酶学特性的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 中心复合响应面结果分析 |
| 3.3.3 PAL-CLEAs 及 HM-PAL-CLEAs 的形态 |
| 3.3.4 游离酶、PAL-CLEAs 和 HM-PAL-CLEAs 动力学参数测定 |
| 3.3.5 pH 及温度对游离酶、PAL-CLEAs 及 HM-PAL-CLEAs 的影响 |
| 3.3.6 游离酶、PAL-CLEAs 及 HM-PAL-CLEAs 酸碱处理稳定性 |
| 3.3.7 游离酶、PAL-CLEAs 及 HM-PAL-CLEAs 热稳定性 |
| 3.3.8 游离酶、PAL-CLEAs 及 HM-PAL-CLEAs 变性剂稳定性 |
| 3.3.9 游离酶、PAL-CLEAs 及 HM-PAL-CLEAs 储存稳定性 |
| 3.3.10 PAL-CLEAs 及 HM-PAL-CLEAs 重复使用性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 磁性杂体脂肪酶交联酶聚体的制备及酶学特性的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 脂肪酶交联酶聚体制备条件的优化 |
| 4.3.2 不同载体质量对固定化的影响 |
| 4.3.5 CSL-CLEAs 及 HM-CSL-CLEAs 的形态 |
| 4.3.6 游离酶、CSL-CLEAs、HM-CSL-CLEAs 动力学参数测定 |
| 4.3.7 pH 及温度对游离酶、CSL-CLEAs、HM-CSL-CLEAs 的影响 |
| 4.3.8 游离酶、CSL-CLEAs、HM-CSL-CLEAs 的热稳定性 |
| 4.3.9 游离酶、CAL-CLEAs、HM-CSL-CLEAs 的储存稳定性 |
| 4.3.10 CSL-CLEAs 和 HM-CSL-CLEAs 重复使用性的考察 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间所发表的论文 |
| 致谢 |
四、基于苯丙氨酸解氨酶的生物传感器线性化研究（论文参考文献）
- [1]代谢工程改造酿酒酵母生产β-苯乙醇[D]. 朱灵桓. 江南大学, 2021(01)
- [2]无细胞合成体系中丙二酸单酰辅酶A再生的研究[D]. 聂也森. 扬州大学, 2021(08)
- [3]重组大肠杆菌全细胞合成覆盆子酮的研究[D]. 杨波. 江南大学, 2021(01)
- [4]四个Kelch类型F-box基因TaFBK在小麦响应逆境胁迫中的功能研究[D]. 魏春茹. 河北农业大学, 2021
- [5]毛蕊花糖苷的生物合成研究进展[J]. 翟君叶,成旭,孙泽敏,李春,吕波. 中国生物工程杂志, 2021(05)
- [6]代谢工程改造酿酒酵母从头合成黄杉素[D]. 高松. 江南大学, 2020
- [7]代谢工程大肠杆菌合成白藜芦醇[D]. 赵莹. 天津大学, 2019(01)
- [8]重组人和果蝇乙酰胆碱酯酶在毕赤酵母中分泌表达及对农药敏感性评估[D]. 杨芳芳. 浙江大学, 2019(03)
- [9]基于静态与动态调控策略的柚皮素生物合成研究[D]. 周胜虎. 江南大学, 2018(05)
- [10]磁性杂体交联酶聚集体的制备及酶学特性的研究[D]. 崔立立. 河北科技大学, 2014(03)