一、乙酰肝素酶与肿瘤转移（论文文献综述）
蔡智[1]（2021）在《仿肝素含糖聚合物的合成及其抗肿瘤转移作用研究》文中研究说明天然肝素（heparin,Hep）是一种由糖醛酸和己糖胺等组成的硫酸化线状糖胺聚糖,在临床治疗中广泛地作为抗凝血药物使用。近年来,肝素被发现拥有多种抗肿瘤转移活性。然而在临床使用中,由于肝素的抗凝血性与复杂结构,长期使用肝素可能会导致出血、血小板减少、低血钾等一系列风险,这限制了肝素在肿瘤治疗中的广泛应用。含糖聚合物（Glycopolymer）是由人工合成、侧链或末端嵌有寡糖或单糖的高分子,其结构中含有的多个糖基能通过“糖簇效应”大大提高与配体的结合能力,提高生理活性。目前,设计含糖聚合物以模拟或改性天然多糖,用于治疗包括恶性肿瘤在内的多种疾病,已经取得了诸多成果。因此,开发一种拥有抗肿瘤转移活性的低抗凝仿肝素含糖聚合物,已经成为了一种有潜力而现实的需求。目前,针对仿肝素含糖聚合物的研究还较少,因此,本论文设计合成了一系列刷状结构的新型含糖聚合物用于肿瘤研究,其中包括以肝素酶解后所得的肝素二糖为主要原料,通过引入不饱和双键进一步聚合制备的多种仿肝素含糖聚合物。主要内容如下:（1）制备了一种基于含糖聚合物构建的新型肿瘤细胞亲和荧光探针。首先将带有不饱和双键的可聚合葡萄糖单体与带有不饱和双键的可聚合新型萘酰亚胺类荧光分子共聚为含糖聚合物,而后将二者作为亲水端,苯乙烯为疏水端进行嵌段聚合,再以4-酰氯苯硼酸接枝修饰,得到该种两亲性荧光含糖纳米粒子。这种荧光含糖纳米粒子拥有作为药物载体开发的潜力,能够在水溶液中自组装为粒径均一的胶束,且具有良好的生物相容性。该纳米粒子能够作为荧光探针使用,由于其高密度结构对肿瘤细胞的亲和力,对肿瘤细胞表现出良好的染色标记效果。（2）遵循先聚合再修饰的顺序,制备了一类具抗肿瘤活性的新型仿肝素含糖聚合物（SGPHD）。通过可逆加成-断裂链转移法（RAFT）,将丙烯类小分子甲基丙烯酸乙醇胺（AMA）聚合合成不同长度的聚合物;另一方面使用肝素酶酶解肝素代替化学合成,分离纯化获得其主要结构组成的八种二糖;最终将肝素二糖接枝于聚合物上作为糖基支链,并将未反应的氨基端头硫酸化,得到刷状结构的目标产物。结果表明,这种仿肝素含糖聚合物与肝素相比,拥有良好的生物安全性,保留和增强肝素抗肿瘤活性的同时,抗凝血活性被降低到可忽略不计,在细胞实验中能够抑制小鼠黑色素瘤细胞B16迁移、侵袭和粘附等肿瘤发展和转移的多个关键阶段,显示出治疗肿瘤转移的巨大潜力。（3）遵循先修饰再聚合的顺序,在上述含糖聚合物的基础上,设计使用了一种通用的模块化合成特定糖组成含糖聚合物的策略,制备了一类新型刷状含糖聚合物（BGP）,其中多种表现出被设计的P-选择素亲和性,及因此带来的更强抗肿瘤活性。遵循（1）中的合成顺序,首先通过将肝素二糖等各类单糖或寡糖与甲基丙烯酰肼进行简便的接枝,合成得到对应的可聚合含糖单元。其后,将不同比例的含糖单元混聚,得到目标产物。这种合成策略能够提高含糖聚合物“糖簇”的密度,且能自由调整糖单元的组成,提供了一种通用的目标含糖聚合物来源方法,在后期生物活性筛选中具一定优势。实验结果表明,加入岩藻糖和唾液酸糖单元的BGP,能够模拟P-选择素配体PSGL-1,并有效结合P-选择素;而加入肝素二糖的两种仿肝素含糖聚合物BGP,显示出与肝素类似的抗肿瘤能力,能够抑制肿瘤发展的多个关键步骤;而筛选所得的三者共存的仿肝素含糖聚合物BGP-SFH能够兼有以上活性,不仅能够更好地抑制P-选择素介导的肿瘤细胞粘附,且拥有对活化血小板促进肿瘤发展进程的抑制能力。BGP-SFH由于抗凝活性低,能够增大应用剂量,在小鼠肺转移模型中,显示出良好的抗转移作用。综上,本研究设计合成了多种能够用于肿瘤治疗领域的含糖聚合物。（1）中首先合成的两亲性含糖聚合物,证明含糖聚合物能够借助其密集的糖单元结构,提供良好的水溶性、生物相容性与肿瘤亲和能力,进而能够用于肿瘤细胞标记染色。（2）中合成了一种仿肝素含糖聚合物SGPHD,成功地模拟了肝素类似的抗转移活性,且不具抗凝血风险,这验证了含糖聚合物模拟、改良天然药物开发方法的可行性。在以上二者的基础上,第（3）部分研究使用（1）中先修饰再聚合的合成顺序,以肝素二糖等构建可聚合含糖单体进行聚合,优化了（2）中的仿肝素含糖聚合物结构,成功合成了“糖簇”密度更高、且拥有多种糖单元组合的含糖聚合物,并筛选出抗转移效果最佳的一种含糖聚合物BGP-SFH。这一方面证明,提高含糖聚合物的“糖簇”密度,有助于含糖聚合物的活性提高。另一方面,BGP-SFH通过调整糖单元组分,能够在保留肝素抗转移效果的同时,还能模拟P-选择素配体PSGL-1的结构,提高特定的抗粘附能力,这些结果显示出含糖聚合物构效关系调整的灵活性,以及在临床应用上的巨大潜力,将有助于设计开发治疗效果更佳、活性自定的含糖聚合物药物。
唐黎[2]（2020）在《结直肠癌肝、肺转移预测模型的构建及验证研究与肝素酶在幽门螺杆菌感染慢性胃炎中的作用和机制研究》文中研究指明【前言】结直肠癌及转移性结直肠癌显着地降低了患者的生活质量,严重威胁患者的生命健康,并为患者家庭带来沉重的经济负担。随着肠镜检查的普及,早期诊断发现结肠直肠癌的患者一般具有良好的预后,但仍有约20%的结肠直肠癌患者在首次诊断时就已有肿瘤转移;对于这部分患者,其5年生存率仅有13%。转移发生的部位及转移病灶的数量与患者的生存时间密切相关。结直肠癌转移的主要靶器官是肝脏和肺,晚期患者还将可能出现包括骨转移、脑转移在内的全身多部位转移。但决定结直肠癌转移模式的潜在机制目前仍未被阐明。肝脏血流丰富,门静脉系统是其主要血流来源,临床研究表明,肠道静脉引流进入门静脉系统可能与结直肠癌的肝转移密切相关。肺也是多种不同类型原发肿瘤转移的重要靶器官,部分原因可能是我们的整个心输出量通过肺毛细血管网络循环,有利于肿瘤细胞团块嵌入毛细血管并最终渗出、定植。但肿瘤的转移的模式和靶器官的选择并不能完全用血液或者淋巴的引流来解释。早在19世纪,就有研究者提出肿瘤转移的―种子‖和―土壤‖的假说:将播散的肿瘤细胞比喻为―种子‖,将肿瘤细胞定植的组织和器官比喻为―土壤‖,认为播散的肿瘤细胞（―种子‖）,只有遇到适合其生长的组织微环境（―土壤‖）时才会定植。在临床实践中人们发现,消化系统肿瘤更容易发生肝转移和肺转移,葡萄膜黑色素瘤特别倾向于转移到肝脏,肉瘤更倾向于发生肺转移,而前列腺癌更容易发生骨转移,却很少发生肝转移和肺转移。肿瘤细胞在每个步骤均具有的特定的表型特征,原发肿瘤细胞在转移过程中所获得的遗传和表观遗传改变有助于肿瘤细胞和宿主的相互作用。因此研究原发性肿瘤和转移性肿瘤之间的基因表达的相似性和差异性,将有助于解析转移过程中靶器官选择的分子机制,并为预防及改善转移性肿瘤的治疗的提供有益的参考。【研究目的】现今大量的研究多采用分子生物学方法来解析转移过程中某一基因及其产物在促进或抑制转移过程中的具体变化,少有研究关注转移过程中的这类基因或其产物在整体转录水平的变化。本研究拟在宏观尺度上,采用严谨的生物信息学和统计学方法,对结直肠癌转移样本的高通量基因阵列数据集进行了分析,以识别出与结直肠癌细胞肝转移和肺转移的密切相关的关键基因及关键信号通路,并以此构建能预测结直肠癌肝转移和肺转移的回归模型。【研究方法】本研究中使用三组GEO数据库中的人结直肠癌样本的基因表达芯片数据集和本院的结直肠癌临床样本为研究对象。使用File Zilla软件下载全部入选样本的基因表达芯片的原始数据集。使用R语言和Rstudio为分析和研究平台。使用affy软件包,通过基因芯片原始文件,读取芯片原始文件中的所有样本中的所有已知基因的表达值。使用imput软件包,采用最近邻平均算法补齐缺失值。使用sva软件包,通过经验贝叶斯算法移除三个数据集之间的批次效应。使用主流的基因差异表达软件包limma,计算出各样本分组之间差异表达基因（DEGs）。差异表达基因的选取标准为:Adjusted p value（FDR）<0.01并且|log2（Fold Change）|>1。使用蛋白互作分析平台STRING,绘制出肝转移和肺转移相关差异表达基因的蛋白或者网络。使用Cytoscape软件进行蛋白质-蛋白质互作网络关系的可视化。使用Cytoscape软件中的Clue Go插件对肝转移和肺转移差异表达基因进行GO生物学过程注释和KEGG通路分析,绘制基因功能网络图。使用最佳子集回归、向后逐步回归进一步筛选肝转移和肺转移差异基因。使用本院的结直肠癌肝转移和肺转移样本的石蜡切片提取总RNA,通过q RT-PCR获取基因的表达值。使用ROC曲线为验证工具,使用临床样本的基因表达数据作为验证数据集,评估自建的回归模型在预测结直肠癌肝转移和肺转移样本的效能。【研究结果】1、根据纳入和排除标准选择三个GEO数据集（GSE68468,GSE41258和GSE49355）进行分析。共纳入712个样本的基因表达阵列数据,包括392个原发性结直肠癌组织,127个正常结肠组织,113个肝转移组织,26个正常肝组织,40个肺转移组织和14个正常肺组织。通过组与组之间的比较找到:1832个[肝转移组织vs.正常肝脏组织]的差异表达基因;1243个[肺转移组织vs.正常肺组织]的差异表达基因;1765个[正常肝组织vs.正常结肠组织]的差异表达基因;1242个[正常肺组织vs.正常结肠组织]的差异表达基因;680个[肝转移组织vs.正常结肠组织]的差异表达基因;602个[肺转移组织vs.正常结肠组织]的差异表达基因;482个[原发结直肠癌组织vs.正常结肠组织]的差异表达基因。2、借助韦恩图工具,最终筛选出104个结直肠癌肝转移相关的差异表达基因,135个结直肠癌肺转移相关的差异表达基因。其中,45个差异表达基因为肝转移和肺转移共有的、59个差异表达基因为结直肠癌肝转移独有、90个差异表达基因为结直肠癌肺转移独有。肝转移与肺转移相关的差异表达基因谱存在较大差异,说明导致结直肠癌细胞发生肝转移与肺转移的机制可能存在较大差异。3、KEGG通路分析发现:包括矿物质吸收和蛋白质消化吸收在内的2条KEGG通路主要富集于肺转移;脂肪消化吸收、抗坏血酸和醛糖代谢、戊糖和戊糖相互转化等KEGG通路主要在肝转移中富集;IL-17信号通路在肝和肺转移灶中均有富集。4、GO生物学过程分析发现以下功能主要集中在肺转移:c AMP介导信号转导调控、对锌离子的应答、铜离子的解毒作用、细胞对铜离子的应答、细胞锌离子的体内稳态、通过调节螯合钙离子的释放来调节心肌的收缩、正向调节钙离子跨膜转运、钙离子跨膜转运蛋白活性的正向调节。包括内胚层细胞分化、细胞外渗、动脉形态发生、主动脉形态发生、涉及离子跨膜转运活性调节在内的功能在肝转移和肺转移中均有富集。没有任何GO生物学过程仅仅富集于肝转移。5、通过最佳子集回归和逐步向后回归进一步筛选基因,我们最终挑选出一个包含7个基因的基因集,用于构建预测结直肠癌肝转移和肺转移的回归模型。这7个基因是:SPARC、COL1A2、MMP9、COL11A1、CXCL12、COL3A1和THBS2,这个基因集组成的回归模型具有最少的基因数量和最大的adjusted R-squared值（0.63）。6、从陆军军医大学新桥医院病理科的档案库中筛选出福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织形式的48份临床样本。包括通过结肠镜检查或结肠切除术收集的19例原发性结直肠癌,通过部分肝切除术或肝脏活检收集的21例肝转移,通过肺部分切除术或肺活检收集的8例肺转移。再通过q RT-PCR验证基因的表达水平。在肺转移标本中,MMP9,COL11A1,CXCL12和THBS2的m RNA表达明显高于肝转移,COL3A1的m RNA表达显着低于肝转移,SPARC和COL1A2的m RNA表达与肝转移无显着性差异。然后将这7个预测基因的表达值用作验证数据集,用以评估回归模型的性能。7、使用通过临床FFPE样本所获得的基因表达数据作为验证数据集,通过ROC曲线的AUC来评估模型的预测能力。结果显示7个基因组成的区别结直肠癌肝转移和肺转移的逻辑回归模型的ROC AUC为83.9%,说明我们可以通过7个基因的表达情况有效的预测结直肠癌肝转移和肺转移。进而说明,这7个基因的表达情况参与了调控了结直肠癌细胞远处转移部位的选择。【结论】1、结合所有肝转移和肺转移独有基因和共有基因的通路分析和GO生物过程分析,我们发现:（1）参与金属离子迁移和吸收、调节细胞间基质降解的基因,对肺转移至关重要;（2）参与糖、蛋白、氨基酸、脂质和能量代谢的基因是肝转移形成的关键基因;（3）参与动脉形态发生、通过趋化因子形成肿瘤微环境、内胚层细胞分化的基因在结直肠癌肝转移和肺转移均为关键基因。2、在结肠直肠癌中,通过SPARC、COL1A2、MMP9、COL11A1、CXCL12、COL3A1、THBS2共7个基因的表达值构建的区别结直肠癌肝转移和肺转移的逻辑回归模型能有效的预测结直肠癌肝转移和肺转移。这7个基因的表达情况参与调控了结直肠癌细胞远处转移靶器官的选择。【意义】本研究采用严谨的生物信息学和统计学方法,对结直肠癌转移样本的高通量基因阵列数据集进行了分析,并在临床转移样本中进行验证,在宏观尺度上,识别出7个与结直肠癌肝转移和肺转移的密切相关的关键基因及信号通路,并以此构建能预测结直肠癌肝转移和肺转移的回归模型。将为进一步解析肿瘤转移靶器官选择的分子机制提供参考,并为结直肠癌转移的精准治疗提供潜在的分子靶点。【前言】幽门螺杆菌感染能诱发胃粘膜内显着的炎症反应,伴有巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞和多核白细胞在内的多种免疫细胞的浸润,但却并不能清除幽门螺杆菌,导致慢性感染和胃粘膜组织持续性损伤。虽然幽门螺杆菌在胃粘膜中的持续定植和慢性感染的机制尚不清楚,但现有研究认为,在幽门螺杆菌感染中,胃上皮细胞与胃粘膜免疫的相互作用是一个关键的促成因素。因此,解析胃粘膜免疫中的关键分子与幽门螺杆菌的相互作用及其机制将有望为幽门螺杆菌的根除、慢性胃炎的治疗及胃癌的预防提供有益的参考。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）不仅是细胞间质中的重要组分,也存在于几乎所有细胞的表面。HSPGs的侧链为各种生物活性分子（细胞因子、趋化因子、生长因子、酶、蛋白酶抑制剂等）提供了无数的锚定位点。在炎症反应中,肝素酶可以通过释放结合在HSPGs上的趋化因子和细胞因子,促进固有免疫细胞活化和迁移,进而调控炎症细胞对炎症刺激的应答。现有研究发现,肝素酶在多种炎性疾病中高表达,但在不同的组织和疾病模型中具有不同的作用。肝素酶在急性胰腺炎、急性血管炎、急性肾小球肾炎、过敏性肺炎中发挥促炎作用;而在中枢系统炎症（阿兹海默病）中,高表达的肝素酶却可以抑制巨噬细胞清除β淀粉蛋白,减轻炎症反应。但肝素酶在幽门螺杆菌感染的慢性胃炎中的作用和机制却仍不清楚。【研究目的】1)研究肝素酶在幽门螺杆菌感染胃粘膜组织中的表达和来源;2)研究肝素酶对胃炎炎症程度和幽门螺杆菌定植的影响;3)研究肝素酶对幽门螺杆菌感染慢性胃炎中浸润的免疫细胞的数量和功能的影响及其机制【研究方法】1)H.pylori感染慢性胃炎患者、慢性萎缩性胃炎患者和健康人的新鲜胃粘膜组织,通过免疫荧光、免疫组化检测肝素在H.pylori慢性感染胃炎中的表达情况。2)从以色列理工大学获取肝素酶敲除（HPA-KO）小鼠。从南昌大学第一附属医院获取幽门螺杆菌PMSS1菌株。使用H.pylori PMSS1建立小鼠H.pylori感染慢性胃炎模型。3)通过HE染色和银染色鉴定H.pylori在胃粘膜中的定植情况。4)使用免疫荧光检测胃粘膜上皮细胞全细胞角蛋白（Pan-cytokeratin）抗体和肝素酶抗体的表达,检测肝素酶在胃粘膜组织中的细胞来源。5)使用人胃粘膜上皮细胞系,通过q RT-PCR和Western Blot,检测不同时间点和不同幽门螺杆菌MOI对胃粘膜上皮细胞细胞肝素酶表达的影响。6)通过HPA-KO小鼠和WT小鼠,检测肝素酶表达情况对胃粘膜炎症程度、免疫细胞浸润、促炎细胞因子的影响。7)使用HPA-KO小鼠、WT小鼠、人的H.pylori慢性感染胃粘膜组织,通过Taqman探针PCR检测肝素酶表达水平对幽门螺杆菌定植的影响以及肝素酶表达水平和H.pylori定植的关系。8)使用q RT-PCR检测常见炎症细胞NK1.1、Gran B（NK细胞）、Langarin（树突状细胞）、F4/80（巨噬细胞）、Ly6g（中性粒细胞）表面标记物在胃粘膜中的表达。初步确定肝素酶的表达水平能影响H.pylori感染胃炎粘膜内巨噬细胞的数量。9)通过流式细胞学,进一步确认了肝素酶缺失可以减少H.pylori感染胃炎胃粘膜组织内的巨噬细胞数量。10)通过q RT-PCR检测不同肝素酶表达水平对巨噬细胞活化标志物i NOS及促炎细胞因子的表达的影响。通过Western Blot检测不同肝素酶表达水平对巨噬细胞M1极化标志物i NOS蛋白水平表达的影响。11)通过Western Blot检测不同肝素酶表达水平下,H.pylori刺激腹腔巨噬细胞将导致哪些信号通路活化。【结果】1)肝素酶在人和小鼠的幽门螺杆菌感染胃炎组织中高表达2)人和小鼠的幽门螺杆菌感染胃炎组织中,高表达的肝素酶主要来自胃粘膜上皮细胞3)肝素酶加重幽门螺杆菌感染胃炎的炎症程度并促进幽门螺杆菌定植4)肝素酶促进巨噬细胞在幽门螺杆菌感染慢性胃炎组织内的浸润5)肝素酶促进幽门螺杆菌诱导的巨噬细胞极化6)肝素酶通过调控p38 MAPK和NF-κB通路促进幽门螺杆菌诱导的巨噬细胞极化【结论】我们首次报道了幽门螺杆菌可以促进肝素酶在胃炎中高表达,高表达的肝素酶通过调控p38 MAPK和NF-κB通路促进幽门螺杆菌诱导的巨噬细胞M1极化,增加促炎细胞因子的表达进而加重胃炎。
郎天群[3]（2020）在《乙酰肝素酶响应性仿生递药系统抗乳腺癌肺转移》文中研究表明乳腺癌严重危害女性健康,肿瘤转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。目前,化疗仍然是临床抗转移性乳腺癌的主要治疗手段,但化疗药物缺乏肿瘤靶向性,导致治疗效率不理想,并引起严重的毒副作用。肿瘤组织与正常组织存在微环境差异,肿瘤微环境具有低pH值、低氧、过表达特定的酶等为药物释放提供生物刺激,多种刺激响应性药物递送系统得以开发。据报道,乙酰肝素酶（Hpa）是哺乳动物体内唯一可以降解硫酸乙酰肝素（HS）的糖苷内切酶,Hpa在大多数肿瘤细胞中高表达,在正常组织中表达量较低。因此,HS可与化疗药物偶联形成前药,在肿瘤部位特异性释放化疗药物。然而,HS具有大量二糖单元糖醛酸及负电荷,作为外源性物质易被单核-巨噬细胞系统清除。红细胞膜具有良好的生物相容性及非免疫原性,并且红细胞膜表面具有的多种标志物蛋白可以协助纳米粒躲避单核-巨噬细胞系统清除及免疫攻击。基于上述背景,我们首先构建红细胞膜包覆的仿生纳米粒靶向递送化疗药物多西他赛（DTX）抗乳腺癌肺转移。将DTX与HS共价连接形成Hpa响应性偶联物前药HS-DTX,该前药可在中性溶液条件下自组装形成胶束。随后将红细胞膜通过挤出法包覆于胶束表面。红细胞膜包覆HS-DTX胶束的纳米粒（rHS-DTX）具有长循环特性,并通过被动靶向作用将胶束富集于原位肿瘤及转移灶。当rHS-DTX被肿瘤细胞摄取,HS-DTX被释放至Hpa高表达细胞质中,HS被降解,DTX以游离药形态释放进而杀伤肿瘤细胞。在正常细胞中,Hpa表达量较低,HS-DTX保持原有状态,显示出较低毒性。实验结果表明,与游离DTX相比,rHS-DTX分别使肿瘤和肺部组织内DTX浓度增加了5.35倍和8.68倍。rHS-DTX原位肿瘤抑制率大于98%,并且可以减少99.6%的肺部转移灶生成。此外,rHS-DTX的生物相容性良好,能够大幅度降低化疗药物造成的毒副作用。在此基础上,我们进一步将HS与吲哚胺-2,3-双加氧酶（IDO）抑制剂NLG919相连接,形成Hpa响应性偶联物前药HS-NLG,其可与HS-DTX自组装形成混合胶束,并包载PD-1/PD-L1通路抑制剂HY19991（HY）形成载药胶束HDNH。为增强胶束主动靶向至肿瘤组织能力,我们采用具有肿瘤归巢性、自主吞噬能力的单核细胞作为载体包载胶束,构建单核细胞包载Hpa响应性前药纳米胶束的仿生药物递送系统HDNH@MC。HDNH@MC可保留单核细胞的性质,主动向肿瘤部位募集。肿瘤细胞高表达的Hpa将HS-DTX、HS-NLG转化为游离药形式并释放HY。首先DTX杀伤肿瘤细胞、释放肿瘤相关抗原（TAA）并引起机体免疫反应。随后NLG919抑制IDO酶活性,减少色氨酸（Try）代谢为犬尿氨酸（Kyn）,降低调节T淋巴细胞（Tregs）数量进而调整肿瘤组织免疫抑制微环境。此外,HY通过阻断PD-1/PD-L1通路,增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤。在化疗药物配合下,NLG919和HY针对不同机制增强免疫系统抗肿瘤活性,提高免疫治疗效果。结果表明,HDNH@MC可主动靶向至肿瘤组织及肺转移灶,杀伤肿瘤细胞,同时可使瘤内Kyn/Trp浓度比大幅降低。经HDNH@MC治疗的小鼠肿瘤内CD8+T细胞浸润及CD8+T细胞/Tregs数量比值分别为混合游离药物组的14.95倍和37.22倍;同时,HDNH@MC组小鼠的乳腺癌肺转移灶数目降低98.2%。最终,基于HDNH@MC的化疗/免疫治疗有效延长荷瘤动物的生存期。本文围绕前药策略、仿生技术及纳米技术,构建了基于硫酸乙酰肝素的乙酰肝素酶响应性前药胶束,为增强其稳定性及肿瘤靶向递送能力,我们采用红细胞膜及单核细胞对其进行包载,构建仿生药物递送系统。该系统可以主动或被动递送药物至肿瘤组织并发生酶响应性释药,通过化疗和免疫治疗的协同效应,有效抑制乳腺癌原位瘤生长及肺部转移,防止复发,具有在转移性乳腺癌治疗领域的应用潜力。
李琦玮[4]（2020）在《益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨》文中进行了进一步梳理研究背景:乳腺癌居于全球女性癌症死亡原因的首位。三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌的一种亚型,其分子表型呈雌激素受体（ER）阴性、孕激素受体（PR）阴性以及人类表皮生长因子受体2（HER2）阴性,约占全部乳腺癌的10-20%。TNBC由于缺乏有效的治疗靶点,往往预后不佳。乙酰肝素酶（HPSE）是哺乳动物体内唯一一种用于切割硫酸乙酰肝素（HS）侧链的β-D-葡萄糖内切糖苷酶,通过切割HS侧链过程重塑细胞外基质（ECM）结构,释放具有生物活性的小分子物质,如生长因子、细胞因子等,协助肿瘤的侵袭与转移,促进肿瘤血管生成,有助于肿瘤的发展。HPSE在多种肿瘤组织中高表达,与肿瘤的恶性进展呈正相关。有研究发现,乙酰肝素酶具有调控细胞基础自噬过程的作用。自噬是一种进化保守的细胞通过溶酶体进行物质降解代谢的过程,一般认为,自噬在肿瘤的发生、发展过程中具有双刃剑的效果。在肿瘤产生之前,自噬可以清除损伤的细胞器或异常合成的蛋白质,减轻炎症反应,避免DNA损伤,预防肿瘤的发生;当体内出现肿瘤细胞时,自噬可以激活免疫细胞的抗原呈递功能,激活T细胞,增强免疫应答功能清除肿瘤细胞。然而肿瘤发生之后,肿瘤细胞可利用自噬作为其必要的生存机制,通过自噬过程为肿瘤细胞的生存和发展提供营养物质和能量支持,以此应对外周环境压力,获得增殖或转移的机会。由于TNBC目前仍然缺乏有效的治疗靶点,且易对治疗产生抵抗,寻找有效的辅助治疗手段提高TNBC的疗效十分重要。研究者对于包括传统中医药在内的补充替代治疗日益关注。千百年来,中药被广泛用于包括癌症在内的各种疾病的治疗。中药结合常规现代治疗有助于提高肿瘤疗效,减轻治疗毒副作用,改善肿瘤患者的生存质量。郁仁存教授、王笑民教授根据多年临证经验总结“益气活血解毒法”,并据此治则创立相关方剂,在临床上治疗各类恶性肿瘤取得了良好的疗效。基于益气活血解毒法,我们选择四种中药单体联合应用并评价其疗效。这些单体包括黄芪甲苷（提取自黄芪,代表“益气”）,龙葵碱（提取自植物龙葵,代表“解毒”）,莲心碱（提取自莲子,代表“解毒”）,川芎嗪（提取自川芎,代表“活血化瘀”）。我们将这四种单体组合简称“SANT”,并对其在肿瘤体内外模型中进行研究。研究目的:评价益气活血解毒中药单体组合SANT对MDA-MB-231 Hpa/Mock肿瘤的影响并分析相关机制。研究方法:在本研究中,我们首先利用数据库进行肝素酶表达与乳腺癌患者生存的相关性分析。利用MTS、trans-well和划痕实验评价SANT对肿瘤细胞增殖、迁移的影响。共聚焦实验用于观察SANT处理后231-Hpa细胞中GFP-RFP-LC3蛋白的变化。免疫印迹实验用于检测相关蛋白标志物表达。动物实验用于评价SANT在体内的疗效与安全性。最后我们采用人类自噬相关PCR微阵列和血管生成蛋白微阵列用于相关机制探索。研究结果:1.HPSE在多种癌症类型中高表达,乳腺癌中HPSE mRNA表达水平超过正常乳腺组织2倍以上。HPSE高表达的乳腺癌患者无复发生存期（P=1.7e-12）与总生存期（P=0.00016）都显着短于HPSE低表达的乳腺癌患者。TNBC患者的HPSE转录效率高于非三阴性乳腺癌患者。2.肿瘤细胞231-Hpa具有显着上调的肝素酶水平,231-Hpa细胞内LC3B-I/-Ⅱ转化率也显着高于231-Mock细胞（P=0.0003）。在乳腺癌原位移植瘤模型中,免疫荧光显示231-Hpa移植瘤HPSE表达显着升高;231-Hpa组肿瘤负荷（0.608g 与 0.437g,每组≥6 只,P=0.0242）,肺重（0.167g 与 0.148g,每组≥6只,P=0.0164）均显着高于对照组。231-Hpa组Ki-67染色与CD31染色均显着高于 231-Mock 组。3.体外实验:经过24小时处理,龙葵碱在0-64μM浓度范围将231-Mock细胞生存率降低近50%,231-Hpa细胞生存率降低约60%;经过48小时处理,龙葵碱对于231-Mock细胞抑制率为68.93%,对231-Hpa细胞抑制率为81.06%。甲基莲心碱（NEF）处理细胞24-48h后也达到60-80%的抑制率。黄芪甲苷和川芎嗪对肿瘤细胞增殖影响不明显。在Trans-well实验中,与对照组相比,SANT对231-Hpa细胞迁移的抑制率达79%,对231-Mock细胞迁移抑制率达72%。划痕实验也取得类似的结果,经过24小时SANT处理,231-Hpa细胞的划痕愈合面积下降了 51.5%,231-Mock细胞的划痕愈合面积下降了 40.6%。SANT在免疫印迹实验中可轻度降低活性形式HPSE的表达,对惰性形式HPSE的影响不明显。SANT和PI-88（肝素酶抑制剂）在体外均可轻微降低肝素酶活性带的表达。在荧光共聚焦观察实验中,转入GFP-RFP-LC3B标记的231-Hpa细胞经过SANT药物处理12h后,可以观察到大量LC3蛋白与溶酶体融合形成的黄色斑点,表示自噬过程的发生。Western实验可见,SANT处理细胞不同时间后引起了 LC3B-Ⅱ表达的升高,SANT与自噬抑制剂CQ联用可使LC3B-Ⅱ表达进一步升高,表明自噬流量的发生。4.体内实验中,SANT与PI-88均可以显着抑制肿瘤的生长（SANT与对照组,360.59 与 598.32mm3,P=0.0381;PI-88 与对照组,3 64.93 与 598.32mm3,P=0.0344）。SANT、PI-88组肿瘤重量较对照组也明显下降（SANT与对照组,0.29与 0.54g,P=0.0046;PI-88 与对照组,0.37 与 0.54g,P=0.0262）。肿瘤组织的免疫组化染色中,与对照组相比,SANT显着降低了 Ki-67表达（17.76±3.41%与7.52±2.02%,P<0.0001）,效果优于PI-88组。SANT明显抑制了微血管（MVD）（57%,P<0.0001）与血管生成拟态（VM）（33%,P=0.0019）的形成,但 PI-88抑制血管生成的效果更佳。安全性评价中,SANT在体内对小鼠的生化指标无明显影响。5.机制探索:对肿瘤组织进行人类自噬相关基因PCR微阵列检验结果显示,SANT处理显着上调了部分自噬过程相关基因,包括ATG10,ATG16L1,ATG16L2,ATG4B,ATG4D,ATG9A等,而PI-88处理组显着下调了一些自噬相关基因如AMBRA1,ATG16L1,ATG4D,BAD,BCL2L1等。肿瘤血管生成相关蛋白微阵列研究结果显示,SANT治疗组中HB-EGF,thrombospondin-2,amphiregulin,leptin,IGFBP-9,EGF,coagulation factor Ⅲ,MMP-9（前体及活性形式）表达上升,serpin E1,platelet factor 4表达下降。结论:肝素酶（HPSE）高表达常见于侵袭性乳腺癌患者中,与不良预后相关。HPSE促进肿瘤增殖,引起小鼠体内肺转移增多,在体外提高了肿瘤细胞自噬水平。体外研究中,SANT抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,并增强肿瘤细胞的自噬水平。体内实验中,SANT在小鼠体内抑制肿瘤生长与血管生成过程。SANT对自噬相关基因或血管生成相关蛋白表达具有调控作用,可能与其肿瘤抑制作用相关。SANT是一种具有前景的用于三阴性乳腺癌辅助治疗的药物,这种药物组合研究拓展了天然化合物的应用思路。
王震[5]（2016）在《乳腺癌患者手术前后乙酰肝素酶mRNA表达的对比研究》文中指出背景目前我国乳腺癌患者越来越多,发病率呈现持续升高的态势,严重危害女性身体健康。在我国的某些城市,该病发病率已超越宫颈癌成为女性头号杀手。较易复发及转移是乳腺癌的特点。故乳腺癌普查以及对可疑病例进行筛选对发现早期乳腺癌患者具有重要意义。HPSE在乳腺癌的复发或转移中发挥及其重要作用。本实验通过聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测乳腺癌患者肿瘤乙酰肝素酶mRNA的表达以及外周血白细胞乙酰肝素酶mRNA在手术前后的表达水平以及健康人中的表达水平差异,探讨乙酰肝素酶mRNA在乳腺癌患者复查及普查中的意义。目的探讨HPSEmRNA在乳腺癌组织及外周血白细胞中的表达以及手术后表达水平的差异。方法选取新乡医学院普外一科2015年6月到10月手术切除的乳腺癌患者术前1天及术后9天晨起空腹外周静脉血标本45例以及肿瘤病理标本及癌旁组织。均为女性,年龄35-67岁,中位年龄50.64±0.88岁,另取乳腺良性肿瘤成年人晨起空腹外周静脉血标本10例作为对照组。所有病人未接受临床上任何治疗,比如放、化疗等。根据TNM标准来进行临床分期。组织标本用液氮保存,待提取组织RNA,另抽取患者外周静脉血1ml,提取总RNA,详细步骤及要求按试剂盒说明书指示。应用RT-PCR技术进行乙酰肝素酶mRNA的扩增,取PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,拍照。测定条带灰度值。统计分析应用SPSS17.0进行,计量资料以x±s表示,两两比较采用t检验,计数资料比较采用χ2检验,检验水准为α=0.05。结果1.乳腺癌患者乙酰肝素酶mRNA的表达情况:经30个RT-PCR循环之后,45例乳腺癌患者外周血有27例（60%）表达乙酰肝素酶mRNA,表达值为53.7%±4.7%,对照组10例均为阴性,45例乳腺癌组织乙酰肝素酶m RNA表达阳性者35例（77.8%）45例癌旁组织阳性者为11例（24.4%）。2.乙酰肝素酶mRNA表达与临床病理特征间的联系:乙酰肝素酶m RNA表达与年龄无关;与肿瘤直径、淋巴结转移、肿瘤分期正相关。3.乳腺癌患者术后外周血乙酰肝素酶mRNA表达水平叫术前明显降低（p<0.001）。结论乙酰肝素酶在乳腺癌患者外周血及肿瘤组织中呈阳性表达,其表达与患者年龄无关,与肿瘤直径、淋巴结转移、肿瘤分期有关;乳腺癌患者术后外周血乙酰肝素酶mRNA表达水平较术前明显降低。预示外周血乙酰肝素酶mRNA可能作为乳腺癌普查、评估预后及术后随访的一个良好的指标。
叶田田[6]（2015）在《基于酶—底物特异性相互作用机制的纳米载药系统靶向肿瘤转移淋巴结的研究》文中指出淋巴转移是肿瘤转移的主要途径之一。淋巴转移程度严重影响了肿瘤患者的治愈率和生存率。因此根据肿瘤淋巴转移的生理特点,针对特异性受体创建主动靶向肿瘤淋巴转移的纳米给药系统,靶向导入治疗药物或成像制剂至转移淋巴结,具有一定的理论意义及实际应用价值。本文基于酶-底物相互作用机制（HPA-LMWH）构建低分子量肝素修饰脂质体,特异性地靶向肿瘤转移淋巴结,并对其转移淋巴结靶向能力、靶向机制、成像效果和治疗效果进行了深入的探讨。透明质酸（HA）和肝素（HEP）是与恶性肿瘤淋巴转移分子标记物密切相关的两种大分子多糖。本文首次选择HA和HEP作为配体,通过静电吸附作用分别构建HA和HEP修饰的多西他赛（DTX）脂质体HA-Lips/DTX和HEP-Lips/DTX,并对其理化性质以及体内转移淋巴结靶向能力进行了考察。两种脂质体荷负电,粒径均在150-200nm之间,具有较高的包封率和良好的稳定性。通过裸鼠脚掌皮下种植宫颈癌Hela细胞建立肿瘤淋巴结转移模型,荷瘤侧脚掌皮下注射HA-Lips/DTX和HEP-Lips/DTX,以淋巴结摄取、脚掌注射部位残留和血药浓度综合比较HA-Lips/DTX和HEP-Lips/DTX的转移淋巴结靶向能力,通过比较可知HEP-Lips/DTX具有更好的转移淋巴结靶向能力。通过应用不同分子量的肝素修饰脂质体,以转移淋巴结摄取量为指标优选低分子量肝素修饰脂质体（LMWH-Lips）进一步研究。本文首次以转移淋巴结中肿瘤细胞大量分泌的乙酰肝素酶（HPA）为靶点,设计了低分子量肝素（LMWH）修饰的脂质体,并对其转移淋巴结靶向机制进行了深入探讨。LMWH-Lips做为成像制剂Cy7和化疗药物DTX的载体,综合考察LMWH-Lips对转移淋巴结的靶向能力,结果表明与未修饰脂质体相比,LMWH-Lips能够显着提高转移淋巴结的成像水平和化疗药物含量,具有良好的转移淋巴结靶向能力。在不同HPA浓度和不同表达水平条件下,考察酶-底物相互作用（HPA-LMWH）作用对LMWH-Lips的转移淋巴结靶向的影响,结果表明转移淋巴结中大量分泌的HPA能识别并结合LMWH,起到滞留LMWH修饰脂质体的作用,HPA同时具有降解脂质体表面LMWH包衣层的能力,消除或部分消除了阻碍肿瘤细胞摄取的因素,改善了肿瘤细胞对LMWH修饰脂质体的摄取作用。通过HPA-LMWH作用,LMWH的修饰提高了脂质体对转移淋巴结的组织水平和细胞水平靶向能力。最后本文对LMWH-Lips/DTX的体内分布和体内外药效进行了研究,结果表明LMWH-Lips/DTX能提高DTX对转移肿瘤细胞和转移淋巴结的治疗效果,并且降低了系统毒性。综上所述,LMWH-Lips可以作为具有前景的药物传递系统用于靶向肿瘤转移淋巴结。
李媛,张丽,孔花青,李杨[7]（2011）在《乙酰肝素酶与肿瘤转移及血管生成的关系》文中认为肿瘤转移主要是肿瘤细胞突破细胞外基质和基底膜构成的两层屏障。乙酰肝素酶是目前发现的动物细胞中唯一能够降解细胞外基质中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖侧链的内源性糖苷酶。研究发现,乙酰肝素酶与肿瘤转移及肿瘤血管生成关系十分密切。本文主要阐述乙酰肝素酶对肿瘤转移及血管生成过程的作用,并初步探讨了研究乙酰肝素酶抑制剂的意义及现状。
张文娟,任明姬[8]（2010）在《乙酰肝素酶研究进展》文中研究指明乙酰肝素酶是目前发现的哺乳动物细胞中唯一能切割细胞外基质中硫酸肝素蛋白多糖侧链的内源性糖苷酶。本文介绍了乙酰肝素酶的分子结构、功能、分子特性、基因定位和酶的活性调控,并对该酶促进血管生成、肿瘤浸润、参与胚胎和组织发育等机制进行了综述。
李燕杰,李淑莲[9]（2008）在《乙酰肝素酶的分子特性及其在生理病理过程中的作用》文中研究说明乙酰肝素酶是目前发现的哺乳动物细胞中唯一能切割硫酸肝素蛋白多糖侧链-硫酸乙酰肝素的内源性糖苷酶,切割影响一系列生理和病理过程。对其深入研究将有助于揭示组织修复、发育、血管形成、自身免疫及肿瘤转移等生理和病理过程。本文就乙酰肝素酶分子特性及其在生理病理过程中的作用和表达调控的研究进展进行综述。
杨鹰[10]（2007）在《乙酰肝素酶在卵巢癌血管生成中的作用及姜黄素抑制卵巢癌微血管内皮细胞生长实验研究》文中研究指明卵巢癌（ovarian carcinoma）发病率在妇科恶性肿瘤中仅次于宫颈癌,具有起病隐匿、早期不易发现、易转移、预后差等特点,其发生机制及治疗的探索一直是生物医学研究的热点。乙酰肝素酶是一种内糖苷酶,可降解细胞外基质（extracellular matrix,ECM）和基底膜（basement membrane,BM）中的硫酸乙酰肝素（heparin sulfate,HS）,在恶性肿瘤细胞中乙酰肝素酶普遍存在,卵巢癌中乙酰肝素酶的表达及与患者临床特征的关系值得进一步探索。实体肿瘤的生长必须依赖持续和广泛的肿瘤血管生成,新生血管为肿瘤组织提供营养物质和氧气,又是肿瘤组织发生转移的重要途径。血管内皮细胞生长因子通过与3种选择性表达在血管内皮细胞上的高亲和力酪氨酸受体VEGFR-1（FLT-1）、VEGFR-2（FLK-1）及VEGFR-3（FLT-4）结合,引起一系列的信号传导,促进血管内皮细胞的增殖与迁移,最终引起新生血管形成,在肿瘤的发生、发展以及转移中发挥重要作用。RNAi技术是一种比较新的生物医学研究方法,将与信使RNA（messenger RNA,mRNA）对应的正义RNA（sense RNA）和反义RNA（anti-senseRNA）组成的双链RNA（double strand RNA,dsRNA）导入细胞,可以使mRNA发生特异性降解,导致相应基因的沉默,这种转录后基因沉默机制（post-transcriptional gene silencing,,PTGS）被称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）。RNAi技术将被广泛应用到功能基因组学、基因治疗学、新药开发研究等众多领域。姜黄素有重要的经济价值和广泛的药理作用,如抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、降血脂等,是一种具有良好发展前景的抗癌药物,其抗肿瘤作用日益引起人们的重视,成为研究的热点。本研究拟观察乙酰肝素酶在卵巢癌血管生成中的作用及姜黄素对卵巢癌微血管内皮细胞生长的影响。本实验分四部分:第一,选择65例经病理确诊的卵巢癌患者,采用免疫组化方法检测癌组织中乙酰肝素酶、VEGF、VEGFR1和F8因子的表达情况,探寻乙酰肝素酶表达与卵巢癌临床病理特征及肿瘤血管生成的关系。第二,进行卵巢癌微血管内皮细胞原代培养,观测其细胞生物学特性,采用免疫荧光方法及RT-PCR方法检测卵巢癌微血管内皮细胞乙酰肝素酶表达情况。第三,进行卵巢癌微血管内皮细胞乙酰肝素酶表达的RNA干扰实验,检测卵巢癌微血管内皮细胞形态变化、细胞活性、乙酰肝素酶基因mRNA水平及蛋白表达,VEGF蛋白表达及血管内皮细胞增殖和凋亡的变化。第四,在卵巢癌微血管内皮细胞中加入不同剂量的姜黄素共培养,观察卵巢癌微血管内皮细胞存活率、细胞增殖率等变化,采用免疫荧光染色和RT-PCR法检测血管内皮细胞中乙酰肝素酶表达变化,探讨姜黄素对卵巢癌微血管内皮细胞的影响。主要结果及结论如下:第一部分:卵巢癌乙酰肝素酶表达特征及与血管生成关系研究1.12例正常卵巢组织中乙酰肝素酶无阳性表达,阳性率为0%,65例卵巢癌中乙酰肝素酶阳性51例,阳性率为78.5%,两组乙酰肝素酶表达差异非常显着。提示卵巢癌中乙酰肝素酶表达具有肿瘤特异性。2.＜50岁组27例中21例乙酰肝素酶表达阳性,阳性率为77.8%,≥50岁组38例中30例阳性,阳性率为78.9%,无显着性差异。浆液性囊腺癌30例中25例乙酰肝素酶表达阳性,阳性率为83.3%,粘液性囊腺癌21例中16例阳性,阳性率为76.2%,其他类型14例卵巢癌腺癌中10例阳性,阳性率为71.4%,差异不显着。提示卵巢癌乙酰肝素酶表达与卵巢癌组织类型及患者的年龄无相关性。3.早期卵巢癌组织12例中乙酰肝素酶阳性3例,晚期卵巢癌组织53例中乙酰肝素酶阳性48例,组间差异显着。高分化卵巢癌5例中乙酰肝素酶阳性表达1例,中分化卵巢癌15例中乙酰肝素酶阳性表达6例,低分化卵巢癌45例中乙酰肝素酶阳性表达44例,组间差异显着。提示卵巢癌乙酰肝素酶表达与卵巢癌病理分级有显着相关性,分化越低的卵巢癌,乙酰肝素酶表达越强;卵巢癌乙酰肝素酶表达与卵巢癌临床分期有显着相关性,晚期卵巢癌乙酰肝素酶表达强于早期卵巢癌。4.VEGF表达强度在卵巢癌患者不同年龄组中无显着区别,在卵巢癌不同组织学类型中无显着差异,临床晚期卵巢癌中VEGF表达强度高于早期卵巢癌,高中分化卵巢癌和低分化卵巢癌组VEGF表达强度显着不同,以低分化癌组表达为高。卵巢癌乙酰肝素酶表达强度变化与VEGF表达强度呈相同趋势,统计分析表明,卵巢癌VEGF表达强度与乙酰肝素酶表达强度呈正相关,相关系数为0.647。5.卵巢癌不同年龄组及不同组织学类型中VEGFR1表达强度无显着区别,临床晚期卵巢癌VEGFR1表达强度显着高于早期卵巢癌,低分化卵巢癌VEGFR1表达强度显着高于高中分化卵巢癌组。统计分析表明,卵巢癌VEGFR1表达强度与乙酰肝素酶表达强度呈正相关,相关系数为0.612。6.卵巢癌不同年龄组及不同组织学类型中MVD无显着区别,临床晚期卵巢癌MVD显着高于早期卵巢癌,低分化卵巢癌MVD显着高于高中分化卵巢癌。统计分析表明,卵巢癌MVD与VEGF、VEGFR1及乙酰肝素酶表达强度呈正相关,相关系数分别为0.754,0.713和0.669。提示乙酰肝素酶通过释放、激活VEGF来促进血管的生成,乙酰肝素酶和VEGF在卵巢癌新生血管生成过程中发挥协同的作用。第二部分:人卵巢癌微血管内皮细胞分离培养及乙酰肝素酶表达研究1.成功进行人卵巢癌微血管内皮细胞原代培养,细胞形态学观察见人卵巢癌微血管内皮细胞呈短梭形或多边形,细胞排列紧密,边界清晰。细胞活力测定人卵巢癌微血管内皮细胞活力为95%以上。卵巢癌微血管内皮细胞FⅧ因子免疫荧光化学检测,细胞胞浆为绿色荧光,证实为内皮细胞。为研究肿瘤血管新生机制及抗血管生成治疗提供了理想的体外实验模型。2.乙酰肝素酶表达免疫荧光染色见乙酰肝素酶主要表达于血管内皮细胞胞浆,胞核未见染色,OdMEC组乙酰肝素酶表达明显高于HUVEC组。RT-PCR检测结果可见OdMEC组乙酰肝素酶mRNA表达明显高于HUVEC组,提示乙酰肝素酶是OdMEC组内皮细胞区别于HUVEC组内皮细胞的主要生物学标志之一。第三部分:RNA干扰沉默乙酰肝素酶基因表达对卵巢癌微血管内皮细胞影响实验研究1.应用含绿色荧光蛋白的载体作对照转染,发现血管内皮细胞乙酰肝素酶siRNA转染效率可达到95%以上。提示乙酰肝素酶siRNA得到了高效转染。2.实验组以乙酰肝素酶siRNA转染血管内皮细胞,并于2、4、6、8d检测乙酰肝素酶表达,结果发现微血管内皮细胞乙酰肝素酶mRNA水平显着降低、蛋白水平显着降低（免疫荧光法、WB法）。提示乙酰肝素酶siRNA转染可显着抑制卵巢癌微血管内皮细胞乙酰肝素酶的转录及蛋白表达。3.乙酰肝素酶siRNA转染后血管内皮细胞VEGF的WB检测发现,实验组加入不同浓度SiRNA处理后,随着时间增加,VEGF表达降低,对照组无显着改变。提示乙酰肝素酶转录水平及蛋白表达受抑制后降低了VEGF的表达。4.MTT法检测细胞活力发现乙酰肝素酶siRNA转染后血管内皮细胞活力降低,随着时间增加,MTT检测吸光度值变化不大,而正常组和对照组随时间增加呈上升趋势。细胞增殖指数检测发现乙酰肝素酶siRNA转染后血管内皮细胞增殖指数显着下降。流式细胞仪检测发现乙酰肝素酶siRNA转染后血管内皮细胞凋亡指数显着上升。提示RNAi可有效沉默血管内皮细胞乙酰肝素酶表达,降低VEGF表达,抑制血管内皮细胞增殖,并诱导细胞凋亡,RNAi可能为肿瘤治疗提供新的途径。第四部分:姜黄素对卵巢癌微血管内皮细胞生物学特性及乙酰肝素酶表达的影响1.细胞形态观察见姜黄素组培养细胞增殖速度减慢,细胞生长密度减小,细胞出现皱缩,折光性减低,随姜黄素浓度增加可见细胞脱落、脱壁漂浮甚至破碎现象,72h可见细胞成大片脱落,有明显的时间和浓度依赖关系。提示姜黄素（2-250ug/ml）能显着抑制人卵巢癌微血管内皮细胞的活性,具有剂量和时间依赖性。2.细胞生长抑制率检测结果表明,姜黄素对卵巢癌血管内皮细胞抑制作用明显,与阴性对照比较差异显着,有显着的剂量依赖效应。姜黄素组对血管内皮细胞增殖指数影响检查可见姜黄素组细胞增殖指数显着下降,同时观察到G0/G1期前出现明显亚二倍体峰,即凋亡峰。提示姜黄素（2-250ug/ml）能显着抑制人卵巢癌微血管内皮细胞的增殖活性,降低增殖指数,具有剂量和时间依赖性。3.免疫荧光法检测内皮细胞乙酰肝素酶表达结果显示,姜黄素组内皮细胞乙酰肝素酶表达显着下降,有显着的剂量依赖抑制效应。提示姜黄素（2-250ug/ml）能显着降低人卵巢癌微血管内皮细胞乙酰肝素酶基因mRNA转录和蛋白的表达。4.细胞培养上清液MDA及LDH活力检测结果显示,姜黄素组细胞培养液上清LDH活性显着升高,MDA含量显着增加。提示高浓度姜黄素具有显着的细胞损伤效应。
二、乙酰肝素酶与肿瘤转移（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙酰肝素酶与肿瘤转移（论文提纲范文）
（1）仿肝素含糖聚合物的合成及其抗肿瘤转移作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肿瘤转移与当前药物治疗方法 |
| 1.1.1 肿瘤转移的过程 |
| 1.1.2 抗肿瘤转移药物研究进展 |
| 1.2 糖与肿瘤 |
| 1.2.1 肿瘤与葡萄糖代谢 |
| 1.2.2 肿瘤与唾液酸 |
| 1.2.3 多糖用于治疗肿瘤 |
| 1.2.4 肝素与抗肿瘤 |
| 1.3 功能可调控的含糖聚合物 |
| 1.3.1 含糖聚合物的合成 |
| 1.3.2 含糖聚合物模拟具有抗肿瘤功能的天然多糖 |
| 1.3.3 通过含糖聚合物研究糖与相关蛋白的作用机制 |
| 1.3.4 含糖聚合物用于药物载体 |
| 1.4 本论文研究的意义及目的 |
| 第二章 基于含糖聚合物构建的肿瘤细胞亲和荧光探针设计、制备及其染色研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 合成部分 |
| 2.3.1.1 荧光中间体F2的制备 |
| 2.3.1.2 荧光中间体F3的制备 |
| 2.3.1.3 可聚合萘酰亚胺荧光分子F4(NPBE)的的制备 |
| 2.3.1.4 化合物丙烯酰胺丙炔c的制备 |
| 2.3.1.5 1-溴代四乙酰葡萄糖的制备 |
| 2.3.1.6 1-叠氮四乙酰葡萄糖的制备 |
| 2.3.1.7 丙烯葡萄糖单体(四乙酰葡萄糖基-1-三唑-4-丙烯酰胺)的制备 |
| 2.3.1.8 丙烯葡萄糖单体脱乙酰 |
| 2.3.1.9 RAFT聚合合成荧光含糖聚合物PGN |
| 2.3.1.10 嵌段聚合合成两亲性荧光含糖聚合物探针PGNP |
| 2.3.1.11 苯硼酸修饰合成两亲性荧光含糖聚合物探针PGNP-B |
| 2.3.2 检测部分 |
| 2.3.2.1 荧光探针的粒径测试 |
| 2.3.2.2 细胞毒性测试 |
| 2.3.2.3 荧光探针细胞染色流式检测 |
| 2.3.2.4 荧光探针染色的共聚焦分析 |
| 2.3.2.5 统计学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 可聚合单体的表征 |
| 2.4.2 两亲性荧光含糖聚合物的表征 |
| 2.4.3 .两亲性荧光探针PNGP-B的荧光表征 |
| 2.4.4 两亲性荧光探针PNGP-B的生物安全性 |
| 2.4.5 .荧光探针的肿瘤细胞靶向性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于肝素二糖的仿肝素含糖聚合物的合成及抗肿瘤活性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 合成部分 |
| 3.3.1.1 甲基丙烯酰乙醇胺(AMA)的合成 |
| 3.3.1.2 聚甲基丙烯酰乙醇胺(PAMA)的合成 |
| 3.3.1.3 肝素二糖的酶解 |
| 3.3.1.4 肝素二糖的纯化和分离 |
| 3.3.1.5 仿肝素结构含糖聚合物GPHD的接枝合成 |
| 3.3.1.6 GPHD硫酸化合成SGPHD |
| 3.3.2 检测部分 |
| 3.3.2.0 体外细胞毒性 |
| 3.3.2.1 划痕实验 |
| 3.3.2.2 Transwell细胞迁移实验 |
| 3.3.2.3 内皮细胞增殖实验 |
| 3.3.2.4 肿瘤-内皮细胞粘附实验 |
| 3.3.2.5 肿瘤-血小板粘附实验 |
| 3.3.2.6 乙酰肝素酶ELISA |
| 3.3.2.7 抗凝血测试 |
| 3.3.2.8 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 不同长度PAMA的聚合与表征 |
| 3.4.2 肝素二糖的降解、分离和纯化 |
| 3.4.3 SGPHD的制备与表征 |
| 3.4.4 不同长度PAMA的聚合与表征 |
| 3.4.5 SGPHD抑制肿瘤细胞迁移能力 |
| 3.4.6 SGPHD的抗血行转移能力 |
| 3.4.7 SGPHD的低抗凝特性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 具有P-选择素高亲和性的仿肝素含糖聚合物的设计、合成与抗肿瘤转移活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 合成部分 |
| 4.3.1.1 甲基丙烯酰肼的合成 |
| 4.3.1.2 可聚合含糖单体的合成 |
| 4.3.1.3 仿肝素刷状含糖聚合物BGP的 RAFT合成 |
| 4.3.2 检测部分 |
| 4.3.2.1 体外细胞毒性 |
| 4.3.2.2 B16 细胞-HMEC-1 细胞静态粘附实验 |
| 4.3.2.3 B16细胞-血小板粘附实验 |
| 4.3.2.4 P-选择素结合实验 |
| 4.3.2.5 活化血小板释放物促进B16细胞增殖实验 |
| 4.3.2.6 活化血小板释放VEGF实验 |
| 4.3.2.7 B16细胞-血小板粘附实验 |
| 4.3.2.8 乙酰肝素酶活性ELISA |
| 4.3.2.9 抗凝血实验 |
| 4.3.2.10 生物安全性实验 |
| 4.3.2.11 小鼠肺转移模型 |
| 4.3.2.12 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 可聚合含糖单体的合成 |
| 4.4.2 BGP的设计与聚合 |
| 4.4.3 BGP的生物毒性 |
| 4.4.4 BGP通过结合P-选择素,抑制肿瘤细胞粘附 |
| 4.4.5 BGP抑制血小板活化关联的肿瘤发展 |
| 4.4.6 BGP抑制乙酰肝素酶活性 |
| 4.4.7 BGP抑制小鼠肺转移 |
| 4.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（2）结直肠癌肝、肺转移预测模型的构建及验证研究与肝素酶在幽门螺杆菌感染慢性胃炎中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分 结直肠癌肝、肺转移预测模型的构建及验证研究 |
| 英文缩略词表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 筛选结直肠癌肝转移、肺转移相关的差异表达基因 |
| 2.0 引言 |
| 2.1 实验仪器和材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 结直肠癌肝转移、肺转移相关差异表达基因的功能分析 |
| 3.0 引言 |
| 3.1 实验仪器和材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 构建用于预测结直肠癌肝转移和肺转移的回归模型 |
| 4.0 引言 |
| 4.1 实验仪器和材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 临床样本验证结直肠癌肝、肺转移的预测模型 |
| 5.0 引言 |
| 5.1 实验仪器和材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第一部分 总结 |
| 第二部分 肝素酶在幽门螺杆菌感染慢性胃炎中的作用和机制研究 |
| 英文缩略词表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 试验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 乙酰肝素酶在急、慢性炎症性疾病中的功能和作用模式 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）乙酰肝素酶响应性仿生递药系统抗乳腺癌肺转移（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 红细胞膜包覆硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物胶束的纳米粒(rHS-DTX)构建与表征 |
| 第一节 硫酸乙酰肝素-多西他赛偶联物前药(HS-DTX)的合成与表征 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 rHS-DTX纳米粒的构建与表征 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 rHS-DTX的细胞摄取 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四节 rHS-DTX的细胞毒性 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 rHS-DTX的体内分布和初步药效评价 |
| 第一节 rHS-DTX的组织分布 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 rHS-DTX体内抑制乳腺癌原位瘤生长及肺转移效果 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 rHS-DTX的初步生物安全性评价 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 单核细胞包载硫酸乙酰肝素-多西他赛/NLG919 偶联物载HY19991 混合胶束的仿生递药系统(HDNH@MC)构建与表征…. |
| 第一节 硫酸乙酰肝素-NLG919 偶联物前药(HS-NLG)的合成与表征 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 HDNH@MC的构建与表征 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 HDNH@MC对乳腺癌细胞的影响 |
| 第一节 HDNH@MC的细胞摄取 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 HDNH@MC的细胞毒性 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 HDNH@MC体外抑制IDO酶活性 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 HDNH@MC的体内分布和初步药效评价 |
| 第一节 HDNH@MC的组织分布 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 HDNH@MC的药动学研究 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 HDNH@MC体内抑制乳腺癌原位瘤生长及肺转移效果 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四节 HDNH@MC的免疫学效应 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第五节 HDNH@MC的初步生物安全性评价 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 结论与创新性分析 |
| 附录 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 文献综述一 天然药物调控自噬治疗肿瘤及基于益气活血解毒理论的应用 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 自噬影响肿瘤发生与转移的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述三 肝素酶与血管生成相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述四 三阴性乳腺癌肿瘤异质性与治疗研究进展 |
| 辨文献 |
| 第二部分 乙酰肝素酶对MDA-MB-231乳腺癌肿瘤生长、自噬、血管生成的干预作用 |
| 实验一 乙酰肝素酶对乳腺癌患者生存情况的影响分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 乙酰肝素酶对MDA-MB-231细胞自噬水平的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 MDA-MB-231乳腺癌乳垫原位移植瘤模型建立以及乙酰肝素酶表达水平对体内肿瘤生长及血管生成的干预作用 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三部分 益气活血解毒中药对HPSE高表达乳腺癌体内外的干预作用及自噬及血管生成方面的机制研究 |
| 实验一 SANT对乳腺癌细胞生长的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 SANT对乳腺癌细胞迁移的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 SANT对乳腺癌细胞肝素酶表达及自噬的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验四 SANT对小鼠肿瘤生长的抑制作用及安全性评价 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验五 SANT对肿瘤血管生成的干预作用及机制分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验六 SANT对肿瘤组织自噬相关基因表达的影响及分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）乳腺癌患者手术前后乙酰肝素酶mRNA表达的对比研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述：乙酰肝素酶与乳腺癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于酶—底物特异性相互作用机制的纳米载药系统靶向肿瘤转移淋巴结的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 淋巴系统的解剖结构和生理功能 |
| 2 淋巴系统在肿瘤转移中的作用 |
| 2.1 降解酶介导的转移-非活性作用 |
| 2.2 新生淋巴管介导的转移-活性作用 |
| 2.3 淋巴系统在肿瘤诊断和治疗中的作用 |
| 3 乙酰肝素酶(HPA)在肿瘤侵袭和转移过程中的作用 |
| 3.1 HPA的分子结构与表达 |
| 3.2 HPA与肿瘤的侵袭与转移 |
| 3.2.1 HSPGs/HS |
| 3.2.2 肿瘤发展过程中HPA的多种作用(酶活作用和非酶活作用) |
| 3.2.2.1 HPA非酶活作用 |
| 3.2.2.2 HPA酶活作用 |
| 3.3 HPA作为肿瘤治疗的靶点 |
| 4 肝素(Heparin)在肿瘤侵袭和转移中的作用 |
| 4.1 肝素的结构 |
| 4.2 低分子量肝素的结构与制备 |
| 4.3 肝素的乙酰肝素酶抑制作用 |
| 4.4 肝素的抗肿瘤活性 |
| 4.4.1 原位肿瘤的生长与发展 |
| 4.4.1.1 肿瘤细胞的增殖 |
| 4.4.1.2 肿瘤的血管生成与抗凝剂 |
| 4.4.1.3 免疫系统的影响 |
| 4.4.2 肝素的抗转移活性 |
| 4.4.2.1 细胞运动和抗凝剂 |
| 4.4.2.2 肿瘤细胞的粘附 |
| 5 淋巴靶向脂质体 |
| 5.1 皮下注射部位及淋巴系统生理结构与功能 |
| 5.2 脂质体理化性质对淋巴靶向的影响 |
| 5.2.1 粒径 |
| 5.2.2 脂质体组成 |
| 5.2.3 表面电荷 |
| 5.2.4 分子量 |
| 5.2.5 亲脂性 |
| 5.3 脂质体表面修饰对淋巴靶向的影响 |
| 5.3.1 PEG表面修饰 |
| 5.3.2 配体表面修饰 |
| 5.3.3 生物素表面修饰 |
| 6 本文的设计思路 |
| 7 本文的研究内容 |
| 第一章 HA-Lips/DTX和HEP-Lips/DTX的制备与表征 |
| 1 实验仪器和材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DTX体外分析方法的建立 |
| 2.1.1 供试品溶液的配置 |
| 2.1.2 液相色谱条件 |
| 2.1.3 标准曲线的绘制 |
| 2.1.4 精密度实验 |
| 2.1.5 回收率实验 |
| 2.2 市售DTX制剂Taxotere(?)的制备 |
| 2.3 DTX-Lips的制备 |
| 2.4 HA-Lips/DTX的制备 |
| 2.5 HEP-Lips/DTX的制备 |
| 2.6 DTX- Lips、HA-Lips/DTX和HEP-Lips/DTX的表征 |
| 2.6.1 形态学观察 |
| 2.6.2 粒径和Zeta电位测量 |
| 2.6.3 包封率和载药量测定 |
| 2.7 体外释放研究 |
| 2.8 体外稳定性研究 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 DTX体外分析方法 |
| 3.1.1 标准曲线 |
| 3.1.2 精密度和回收率 |
| 3.2 HA-Lips/DTX的制备和表征 |
| 3.2.1 HA-Lips/DTX的制备 |
| 3.2.2 DDAB加入量对HA-Lips/DTX的粒径和Zeta电位的影响 |
| 3.2.3 HA包衣溶液浓度对HA-Lips/DTX的粒径和Zeta电位的影响 |
| 3.2.4 粒径和Zeta电位 |
| 3.2.5 包封率和载药量 |
| 3.2.6 形态学考察 |
| 3.3 HEP-Lips/DTX的制备和表征 |
| 3.3.1 HEP-Lips/DTX的制备 |
| 3.3.2 DDAB加入量对HEP-Lips/DTX的粒径和Zeta电位的影响 |
| 3.3.3 HEP包衣溶液浓度对HEP-Lips/DTX的粒径和Zeta电位的影响 |
| 3.3.4 粒径和Zeta电位 |
| 3.3.5 包封率和载药量 |
| 3.3.6 形态学考察 |
| 3.4 体外药物释放 |
| 3.5 体外稳定性考察 |
| 4 本章小结 |
| 第二章 HA-Lips/DTX和HEP-Lips/DTX的的淋巴结靶向能力比较 |
| 1 实验动物,仪器与材料 |
| 1.1 实验动物和细胞 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 肿瘤淋巴结转移动物模型的建立 |
| 2.1.1 模型的建立 |
| 2.1.2 模型的验证 |
| 2.2 DTX体内HPLC分析方法的建立 |
| 2.2.1 溶液的配置 |
| 2.2.2 色谱条件 |
| 2.2.3 组织样品和血浆样品的处理 |
| 2.2.4 标准曲线的绘制 |
| 2.2.5 精密度实验 |
| 2.2.6 回收率实验 |
| 2.3 淋巴结靶向能力的考察 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 肿瘤淋巴结转移动物模型的建立与验证 |
| 3.2 DTX体内分析方法 |
| 3.2.1 标准曲线 |
| 3.2.2 精密度和回收率 |
| 3.3 正常淋巴结靶向能力 |
| 3.3.1 药物淋巴结摄取和动力学 |
| 3.3.2 药物注射部位残留和动力学 |
| 3.3.3 药物血药浓度和动力学 |
| 3.4 肿瘤转移淋巴结靶向能力 |
| 3.4.1 淋巴结摄取 |
| 3.4.2 注射部位残留 |
| 3.4.3 血药浓度和动力学 |
| 3.4.4 不同分子量肝素修饰脂质体的转移淋巴结的靶向性 |
| 4 实验讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 LMWH-Lips体外肿瘤细胞摄取和体内转移淋巴结靶向能力的考察 |
| 1 实验仪器和材料 |
| 1.1 实验动物和细胞 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 C6体外分析方法的建立 |
| 2.1.1 供试品溶液的配置 |
| 2.1.2 标准曲线的绘制 |
| 2.1.3 精密度测定 |
| 2.1.4 回收率的测定 |
| 2.2 C6对照溶液的制备 |
| 2.3 C6-Lips和LMWH-Lips/C6的制备 |
| 2.3.1 C6对照溶液的制备 |
| 2.3.2 C6-Lips 的制备 |
| 2.3.3 LMWH-Lips/C6的制备 |
| 2.4 C6-Lips和LMWH-Lips/C6的表征 |
| 2.5 Hela细胞培养 |
| 2.5.1 磷酸盐缓冲液的配置 |
| 2.5.2 细胞培养液的配置 |
| 2.5.3 消化液的配制 |
| 2.5.4 细胞复苏和传代 |
| 2.6 Hela细胞摄取研究 |
| 2.7 肿瘤淋巴结小鼠模型的建立 |
| 2.8 Cy7体外分析方法的建立 |
| 2.8.1 供试品溶液的配置 |
| 2.8.2 标准曲线的绘制 |
| 2.8.3 精密度测定 |
| 2.8.4 回收率的测定 |
| 2.9 Cy7对照溶液的制备 |
| 2.10 Cy7-Lips和LMWH-Lips/Cy7的制备 |
| 2.10.1 Cy7-Lips的制备 |
| 2.10.2 LMWH-Lips/ Cy7的制备 |
| 2.11 Cy7-Lips和LMWH-Lips/Cy7的表征 |
| 2.12 LMWH-Lips/Cy7肿瘤转移淋巴结裸鼠活活体成像实验 |
| 2.13 LMWH-Lips/DTX肿瘤转移淋巴结靶向能力的考察实验 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 C6体外分析方法 |
| 3.2 C6-Lips和LMWH-Lips/C6的理化性质 |
| 3.3 Hela细胞摄取 |
| 3.4 Cy7体外分析方法 |
| 3.5 Cy7-Lips和LMWH-Lips/Cy7的理化性质 |
| 3.6 肿瘤转移淋巴结裸鼠活体成像 |
| 3.6.1 在体成像效果 |
| 3.6.2 离体成像效果 |
| 3.6.3 转移淋巴结摄取的半定量考察 |
| 3.7 转移淋巴结靶向能力 |
| 3.7.1 淋巴摄取 |
| 3.7.2 血药浓度 |
| 3.7.3 注射部位残留 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 LMWH-Lips转移淋巴结靶向机制的研究(HPA-LMWH作用) |
| 1 实验仪器和材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验细胞 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 不同浓度HPA对稳定性的影响 |
| 2.2 不同浓度HPA对体外释放的影响 |
| 2.3 HPA表达的定性测定 |
| 2.3.1 待测样品的处理 |
| 2.3.2 ELISA试剂盒测定 |
| 2.4 HPA表达的定量测定 |
| 2.4.1 待测样品的处理 |
| 2.4.2 标准品孔的制备 |
| 2.4.3 ELISA试剂盒测定 |
| 2.5 细胞培养 |
| 2.6 HPA不同表达水平的细胞摄取(细胞水平) |
| 2.7 HPA不同表达水平的淋巴结摄取(组织水平) |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 HPA-LMWH作用对稳定性的影响 |
| 3.2 HPA-LMWH作用对体外释放行为的影响 |
| 3.3 HPA表达的定性测定 |
| 3.4 HPA表达的定量测定 |
| 3.5 HPA-LMWH作用对细胞摄取的影响 |
| 4 实验讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 LMWEHPE-Lips/DTX组织分布和药效学研究 |
| 1 实验仪器和材料 |
| 1.1 实验动物和细胞 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验材料 |
| 2 试验方法及实验动物 |
| 2.1 Hela细胞培养 |
| 2.2 细胞毒测定 |
| 2.3 DTX体内组织HPLC分析方法 |
| 2.4 肿瘤淋巴结小鼠模型的建立 |
| 2.5 组织分布的研究 |
| 2.5.1 荷瘤裸鼠脚掌皮下给药组织分布的测定 |
| 2.5.2 靶向评价参数 |
| 2.6 LMWH-Lips/DTX初步药效学研究 |
| 2.6.1 实验设计 |
| 2.6.2 考察指标 |
| 3 结果和讨论 |
| 3.1 体外药效学 |
| 3.1.1 Hela细胞生存抑制率 |
| 3.1.2 RAW264.7细胞生存抑制率 |
| 3.1.3 L929细胞生存抑制率 |
| 3.2 体内组织分布 |
| 3.3 体内药效学 |
| 3.3.1 荷瘤裸鼠体重变化 |
| 3.3.2 荷瘤裸鼠转移淋巴结变化 |
| 3.3.3 荷瘤裸鼠荷瘤测脚掌变化 |
| 4 本章小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文 |
| 附件 |
（8）乙酰肝素酶研究进展（论文提纲范文）
| 1 乙酰肝素酶分子特征 |
| 2 乙酰肝素酶的定位及活性调节 |
| 2.1 乙酰肝素酶基因表达调控 |
| 2.2 乙酰肝素酶生物活性调控 |
| 3 内源因子调控 |
| 4 乙酰肝素酶的生物学作用 |
| 4.1 乙酰肝素酶促进肿瘤侵移机制 |
| 4.2 在胚胎和组织发育中的作用 |
（9）乙酰肝素酶的分子特性及其在生理病理过程中的作用（论文提纲范文）
| 1 分子特性 |
| 2 在血管生成中的作用 |
| 3 在炎症中的作用 |
| 4 在胚胎和组织发育中的作用 |
| 5 在肿瘤浸润、转移过程中的作用 |
| 6 在恶性肿瘤中表达的调控 |
| 7 乙酰肝素酶的抑制剂及其临床前景 |
（10）乙酰肝素酶在卵巢癌血管生成中的作用及姜黄素抑制卵巢癌微血管内皮细胞生长实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 乙酰肝素酶在卵巢癌血管生成中的作用及姜黄素抑制卵巢癌微血管内皮细胞生长实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 卵巢癌乙酰肝素酶表达特征及与血管生成关系研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 人卵巢癌微血管内皮细胞分离培养及乙酰肝素酶表达研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 RNA干扰沉默乙酰肝素酶基因表达对卵巢癌微血管内皮细胞影响实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 姜黄素对卵巢癌微血管内皮细胞生物学特性及乙酰肝素酶表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 血管内皮生长因子家族与肿瘤血管及淋巴管生成 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 卵巢癌细胞生物学特性基因调控及诊断治疗进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述三 乙酰肝素酶与肿瘤转移 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表文章及承担课题 |
四、乙酰肝素酶与肿瘤转移（论文参考文献）
- [1]仿肝素含糖聚合物的合成及其抗肿瘤转移作用研究[D]. 蔡智. 江南大学, 2021
- [2]结直肠癌肝、肺转移预测模型的构建及验证研究与肝素酶在幽门螺杆菌感染慢性胃炎中的作用和机制研究[D]. 唐黎. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
- [3]乙酰肝素酶响应性仿生递药系统抗乳腺癌肺转移[D]. 郎天群. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2020(07)
- [4]益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨[D]. 李琦玮. 北京中医药大学, 2020(04)
- [5]乳腺癌患者手术前后乙酰肝素酶mRNA表达的对比研究[D]. 王震. 新乡医学院, 2016(04)
- [6]基于酶—底物特异性相互作用机制的纳米载药系统靶向肿瘤转移淋巴结的研究[D]. 叶田田. 沈阳药科大学, 2015(01)
- [7]乙酰肝素酶与肿瘤转移及血管生成的关系[J]. 李媛,张丽,孔花青,李杨. 食品与药品, 2011(01)
- [8]乙酰肝素酶研究进展[J]. 张文娟,任明姬. 内蒙古医学杂志, 2010(02)
- [9]乙酰肝素酶的分子特性及其在生理病理过程中的作用[J]. 李燕杰,李淑莲. 河南大学学报(医学版), 2008(03)
- [10]乙酰肝素酶在卵巢癌血管生成中的作用及姜黄素抑制卵巢癌微血管内皮细胞生长实验研究[D]. 杨鹰. 第三军医大学, 2007(03)