一、杆状病毒介导LacZ基因转染体外培养的人虹膜色素上皮细胞(英文)（论文文献综述）
冯剑[1]（2021）在《猪γ干扰素与猪α干扰素扩大培养工艺优化》文中研究说明为了适应绿色养殖的需求,本实验室在前期已经利用昆虫杆状病毒表达系统获得了在结构和功能等方面更接近天然的猪IFN-α和猪IFN-γ,并对获得的IFN-α和IFN-γ使用VSV、PRV以及PRRSV进行抗病毒活性检测。在此基础上,本研究进一步优化了利用杆状病毒表达载体生产干扰素的工艺,实现了实验室大规模生产干扰素,以及干扰素产品储存条件的摸索与杆状病毒灭活,为实际大规模的生产提供了技术支持。本研究在实验室内将干扰素表达由原来的5 mL培养体系扩大到200 mL体系,对扩大体系的SF9细胞的最佳生长条件进行摸索。发现在摇瓶中培养1天后,细胞密度达到了1.3×106个/mL处于生长对数期,所以确定了细胞接毒时最佳密度为1.3×106个/mL,为了确定最佳的接毒量和最佳收毒时间,在摇瓶中分别加入200μL、400μL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、12 mL的干扰素种毒,在接毒3天后,每天收取干扰素样品,进行抗病毒活性检测。结果发现IFN-γ在接毒量为4 mL,即0.00053个MOI时,接毒后3天收取干扰素抗病毒活性最佳,IFN-α在接毒量为200μL,即0.00017个MOI时,接毒后3天收取的干扰素抗病毒效果最佳。为了确保表达出的干扰素具有高生物安全性,对重组杆状病毒进行灭活条件的优化,发现使用β-丙内酯（BPL）在稀释度为1:2000时,4℃灭活24 h就可以将猪干扰素α中的杆状病毒完全灭活,然后BPL在37℃条件下降解12 h就可以将BPL完全降解,对细胞没有影响。本研究分别摸索了干扰素的储存时间和储存条件,将生产出的干扰素分成三等份,分别储存在4℃、-20℃、-80℃,间隔2个月时间进行抗病毒活性检测,结果发现最佳的储存方式为-20℃,储存2个月。首先,本研究完成了IFN-α和IFN-γ200 mL培养体系的工艺优化,接着为了保证高生物安全性,完成了对杆状病毒灭活的工艺摸索以及摸索了储存条件和储存方式。为干扰素临床的实际大规模生产和应用提供了重要技术支持。
潘政军[2]（2019）在《Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复兔关节软骨损伤的实验研究》文中研究说明研究目的:探讨抑制细胞调亡的B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因（Bcl-xL）对人脐带血干细胞定向诱导分化的影响,观察Bcl-xL基因修饰的人脐带血干细胞定向诱导分化以后修复兔关节软骨损伤的疗效。研究内容:（1）人脐带血干细胞的获取,分离培养、定向诱导分化成软骨细胞;（2）慢病毒编码的抑制细胞凋亡基因Bcl-xL转染人脐带血干细胞;（3）检测Bcl-xL基因过表达对干细胞凋亡的影响;（4）检测Bcl-xL基因过表达对干细胞分泌II型胶原蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3和基质金属蛋白酶3等蛋白的影响;（5）制造兔膝关节软骨损伤模型;（6）海藻酸钠盐支架包被Bcl-xL基因修饰的人脐带血干细胞,植入并修复兔软骨损伤;（7）检测植入的人脐带血干细胞是否能在异种动物体内存活;（8）HE、MASSON和改良蕃红O-固绿等染色方法观察软骨缺损的修复;（9）免疫组化、实时PCR、WB等方法检测Bcl-xL基因的表达对动物体内软骨细胞分泌II型胶原、半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3等蛋白影响。材料与方法:（1）在正常分娩过程中获得人脐带血,体外分离获取干细胞,贴壁培养。取P2代细胞用TGF-β1因子联合使用胰岛素样生长因-1和地塞米松诱导干细胞向软骨细胞方向分化,培养至细胞爬满玻片时,用甲苯胺蓝染色和免疫组化染色方法鉴定诱导分化的效果,并与对照组比较。（2）用编码Bcl-xL的慢病毒对人脐带血干细胞进行修饰,取第3代人脐带血干细胞接种于6孔板,当细胞融合达到5070%时,用编码Bcl-xL基因的慢病毒载体转染人脐带血干细胞。实验分四组进行,分别为对照组、诱导组、诱导+Bcl-xL慢病毒转染组、诱导+慢病毒空载组。对照组只分离培养干细胞,不加任何诱导因子;诱导组加入TGF-β1等诱导因子;诱导+Bcl-xL慢病毒转染组是在诱导组的基础上再加入编码Bcl-xL基因的慢病毒;空载组是在诱导组的基础上只加入未编码Bcl-xL基因的慢病毒。以上四组继续培养48h,在倒置显微镜下连续观察并记录细胞形态特征;甲苯胺蓝染色证实Bcl-xL基因转染后的干细胞仍具有软骨细胞的特征;通过流式细胞仪鉴定软骨细胞特征性的表面抗原如:CD90和CD105的表达。通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况,评价Bcl-xL基因对干细胞的凋亡的影响。实时PCR检测Bcl-xL基因在mRNA水平的表达;同时以β-actin为内参;Western blotting（WB）印迹法检测Bcl-xL基因在蛋白水平的表达;实时PCR及WB等方法检测Bcl-xL基因表达及其对II型胶原蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3、基质金属蛋白酶3等蛋白表达的影响;SPSS17.0软件统计学分析比较各组间mRNA和蛋白水平表达的差异。（3）制备海藻酸钠支架,加入人脐带血干细胞形成细胞-支架复合物。将1.2%的海藻酸钠溶液滴入102m M氯化钙溶液在模具中凝固形成无细胞的海藻酸钠支架;将人脐带血干细胞加入1.2%的海藻酸钠溶液制成1×106/ml的单细胞悬液,滴入102m M氯化钙溶液在模具中凝固形成含人脐带血干细胞的海藻酸钠支架复合物。（4）制造兔软骨损伤模型,30只三个月大的日本大耳兔,分为5组,每组12只膝关节。麻醉后备皮,双侧后腿膝关节内侧切口进入膝关节,在股骨髁关节面用电钻造成一个直径4mm,深度约3mm柱状缺损,穿透软骨下骨,造成全层关节软骨损伤。按照5种不同的方式修复软骨缺损:假手术组（对照组）:只进行假手术,软骨无损伤;模型组:进行软骨损伤造模而未予其它治疗干预措施,然后直接缝合;空载体治疗组:慢病毒空载体转染人脐带血干细胞,海藻酸钠包被后植入软骨损伤缺损区域;干细胞治疗组:未经慢病毒转染的人脐带血干细胞,海藻酸钠包被后植入软骨损伤缺损区域。Bcl-xL基因修饰治疗组:Bcl-xL基因修饰慢病毒转染人脐带血干细胞,海藻酸钠包被后植入软骨损伤缺损区域。饲养8周后全部动物处死,获取膝关节标本。采用抗人细胞核特异性抗体鉴定植入软骨缺损处的干细胞在正常免疫功能的兔体内是否能存活;观察Bcl-xL基因修饰的人脐带血干细胞移植治疗关节软骨损伤的效果,用HE、MASSON、改良番红O-固绿等染色方法观察关节软骨损伤的修复效果,用免疫组化、实时PCR及WB等方法检测动物体内Bcl-xL基因的表达及其对II型胶原蛋白、半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3等蛋白表达的影响;用SPSS 17.0软件统计学分析比较各组间mRNA和蛋白水平表达的差异。结果:1、人脐带血中可成功分离出具有多向分化潜能的干细胞,并可体外培养、定向诱导分化软骨细胞;2、用编码Bcl-xL的慢病毒对人脐带血干细胞进行修饰,干细胞增殖分化后仍具有软骨细胞特征。干细胞内的Bcl-xL基因在mRNA和蛋白水平的表达均上调;Bcl-xL基因可抑制干细胞的调亡,Bcl-xL基因可促进软骨细胞II型胶原蛋白在mRNA和蛋白水平的表达,显着抑制半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3的表达,组间分析具有统计学意义,P<0.05。3、海藻酸钠盐支架-干细胞复合体植入动物体内,检测到干细胞存活;病理染色显示,各组软骨损伤均有修复,3种染色方式均显示:Bcl-xL基因修饰的干细胞组软骨结构修复最满意,而模型组的修复相对最不满意;免疫组化染色、实时PCR和WB检测结果基本一致:软骨损伤促进了II型胶原纤维在mRNA和蛋白水平的表达,而Bcl-xL基因修饰进一步增加了II型胶原纤维的表达;对于半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3的检测结果显示:与假手术组比较,模型组的半胱氨酸蛋白酶-3和基质金属蛋白酶3表达均明显上调（P<0.05）,而Bcl-xl基因修饰组人脐带血干细胞相对模型组明显下调。组间分析差异显着（P<0.05）。此外,与正常人脐带血干细胞相比,Bcl-xL修饰的干细胞可进一步降低软骨损伤诱导的半胱氨酸蛋白酶-3以及基质金属蛋白酶3的表达,提高II型胶原蛋白的表达。结论:1、人脐带血干细胞可定向诱导分化成软骨细胞,Bcl-xL基因修饰可降低干细胞凋亡。2、移植人脐带血干细胞有利于修复软骨损伤,而Bcl-xL修饰则能提高人脐带血干细胞移植修复软骨损伤的疗效。
赵颖慧[3]（2014）在《鸡输卵管组织特异性启动子克隆及功能验证》文中研究表明由于家禽生物反应器具有生产周期短、蛋白分离纯化容易、易于规模化等优势,在生物学基础研究和生物技术的开发方面有广泛的应用前景；研究、发掘禽卵清蛋白基因（OV）的侧翼特异表达启动子、调控序列和多肽分泌信号序列等是构建禽体内有效调控外源基因表达载体、家禽新型生物反应器的基础。因此,进行了以下研究：1.卵清蛋白启动子克隆及细胞水平评价根据鸡卵清蛋白基因结构特征及生物信息学分析,筛选包含家禽输卵管启动子核心区的0V启动子,设计-1047～+38bp,-1100-+1655bp、-1341～+1652bp的引物,PCR扩增1.1kb、2.7kb、3.0kb的卵清蛋白调控序列,构建输卵管组织特异性真核表达载体,命名为pOV1.1k-GFP、pOV2.7k-GFP、 pOV3.0k-GFP;转染输卵管上皮细胞,PCR、 RT-PCR证明重组载体能够整合到细胞基因组内,并进行转录；各质粒转染组在荧光显微镜下观察均有绿色荧光,证明3种启动子均能驱动GFP表达；转染仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）,PCR、 RT-PCR证明重组载体能够整合到细胞基因组内,并进行转录；荧光显微镜观察各质粒转染组均有绿色荧光,证明这3种启动子均能驱动GFP表达;高内涵成像系统分析,转染效率和平均荧光强度由高到低依次是pOV1.1k-GFP转染组、pOV2.7k-GFP转染组、pOV3.0k-GFP转染组。2.增强子元件对卵清蛋白启动子调控表达效率的影响分别将SV40和CMV的增强子元件插入到2.7kb OV序列上游,构建表达载体pSOV2.7k-GFP、 pCOV2.7k-GFP,克隆-3787bp～-2800bp的雌激素应答元件（ERE）和鸡输卵管特异性增强子样区域（COSE）元件,插入到2.7kb OV序列上游,构建表达载体EOV2.7k-GFP;转染CHO细胞,48h后PCR、RT-PCR结果表明重组质粒能够整合到到细胞基因组内,并进行转录；荧光镜下检测到绿色荧光蛋白,表明OV启动子能驱动GFP表达；高内涵成像系统分析pSOV2.7k GFP、pCOV2.7k-GFP、 pEOV2.7k-GFP转染组GFP的表达效率高于pOV2.7k-GFP转染组,表明SV40. CMV和CE增强元件可以增强卵清蛋白启动子对外源基因的表达调控效率。3.卵清蛋白启动子驱动HA蛋白在CHO细胞表达扩增流感病毒H5N1的HA基因编码序列,置于OV启动子下游构建真核表达载体pOV1.1k-HA、 pOV2.7k-HA、pOV3.0k-HA、pSOV2.7k-HA、pCOV2.7k-HA和pcDNA6.2-HA,转染CHO细胞,PCR. RT-PCR结果表明重组载体能够整合到细胞基因组内,并进行转录；加压筛选的细胞IFA和Western-blot表明,OV启动子在CHO细胞上均能够驱动HA蛋白稳定表达。4.溶菌酶信号肽对外源蛋白分泌表达的影响为使蛋白稳定分泌到胞外,通过延伸PCR在GFP编码序列5’端添加54bp的溶菌酶信号肽序列,置于卵清蛋白5’调控序列下游构建真核表达载体pcDNA6.2-SGFP,转染CHO细胞,48h后PCR、RT-PCR结果表明重组载体能够整合到细胞基因组内,并进行转录;Operetta高内涵成像系统分析细胞阳性率及平均荧光强度,与未加溶菌酶信号肽相比显着降低;Western-blot分析,在上清中检测到GFP蛋白条带,表明信号肽序列能够有效指导外源基因的分泌表达。本研究为鸡输卵管生物反应器的研究奠定了基础。
周国梅[4]（2012）在《鸭甲肝病毒1型一个保守的中和性线性B细胞表位的确定》文中进行了进一步梳理鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis）是由鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus, DHAV）和鸭星状病毒（Duck astrovirus）引起的雏鸭的一种高度致死、传播迅速的病毒性疾病,主要感染1～3周龄雏鸭,死亡率高达90%以上。其中DHAV型鸭肝炎呈世界范围分布,是对养鸭业威胁最大的一种传染病。但是有关DHAV病毒蛋白功能的研究较少。本研究是在已经研制了DHAV-1单克隆抗体的基础上,通过对毒株LY0801的结构蛋白VP1及其分段的基因克隆,表达,免疫活性的检测,对具有病毒中和作用的DHAV-1单克隆抗体4F8所识别的抗原表位进行准确定位,为DHAV-1的诊断、分子流行病学调查、新型表位疫苗的研制提供科学依据。本研究主要包括以下内容：1、5株DHAV-1特异性单克隆抗体识别抗原表位的初步分析本研究通过腹腔注射小白鼠的方法制备了针对5株具有中和性能的DHAV-1的特异性单克隆抗体。以DHAV-1LY0801株的cDNA为模板,通过PCR扩增DHAV-1完整的VP1基因,将其克隆入杆状病毒表达载体中,转染sf9昆虫细胞后,通过IFA确定实验室制备的5株单克隆抗体识别的抗原表位均位于DHAV-1的VP1蛋白上；Western blot试验结果表明：单抗4F8和5G4识别的是线性表位,而单抗1E10、4E6和5E11识别的是构象性表位。2、单克隆抗体4F8识别线性表位的准确定位研究本研究采用交叉重叠法设计引物,构建了13段VP1分段蛋白的pET-32a （+）重组表达质粒,转化到Rosetta菌株中,用IPTG诱导表达融合蛋白,对表达产物SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳确定表达后,用单克隆抗体4F8分别进行Western blot分析,根据Western blot（?）（?）果结合引物设计推测4F8识别的抗原表位；构建表达DHAV-1不同长度VP1蛋白的杆粒,转染sf9昆虫细胞后对蛋白进行诱导表达,使用单克隆抗体4F8对转染昆虫细胞进行IFA检测。根据Western blot和IFA检测结果,使用分子生物学软件对单克隆抗体4F8识别的抗原表位序列进行分析,结果表明,4F8识别的抗原表位是DHAV-1中VP1蛋白的74-82位氨基酸,即74SGEIILTIV82通过与NCBI上发表的序列中DHAV各血清型病毒序列的分析发现,该抗原表位在DHAV-1高度保守,而DHAV-2和DHAV-3分离株均在该位点内存在变异。因此单克隆抗体4F8为DHAV-1的特异性单抗,可用于DHAV-1的免疫诊断。
薛萍[5]（2012）在《角质细胞生长因子-1（KGF-1）在昆虫细胞中的表达及其活性研究》文中进行了进一步梳理角质细胞生长因子-1（（?）eratinocyte growth factor-1, KGF-1即FGF7）,是目前对皮肤损伤修复最有效且特异性最好的成纤维细胞生长因子家族（FGFs）成员之一。KGF-1来源于间质细胞,通过旁分泌方式作用于不同组织来源的上皮细胞,其生理功能主要表现在上皮形态功能的发生、伤口表皮细胞的再生、毛囊的生长和器官的形态发生等方面。临床应用于放化疗后的口腔黏膜炎的治疗,以及一些潜在应用有糖尿病等代谢性疾病引起的慢性伤口愈合、早产儿的主要障碍-表面活性剂的不足和支气管肺发育不良、急性肺损伤的治疗、急性肝损伤的保护及再生等。但是由于KGF-1蛋白表达量（E. coli）（?）低且稳定性差,一直制约着KGF-1蛋白在药物上的研发进程。KGF-1也曾在哺乳动物细胞、植物细胞中尝试表达,但是表达量和稳定性仍然没有得到解决。因此,亟需一种新的方法解决KGF-1的生产问题。昆虫细胞-杆状病毒表达系统（IC-BEVS）在近30年来得到了迅速应用,目前用于商业化表达重组疫苗和药用蛋白,该系统具有表达速度快,可以表达相对较大的目的蛋白,不含有动物病原体,并可以对真核来源的蛋白进行翻译后修饰,活性与天然蛋白类似等优点。因此,本论文使用昆虫细胞作为生物反应器,进行重组KGF-1在昆虫细胞中表达,根据KGF-1蛋白的特点和昆虫表达系统的特性进行研究。首先,从基因水平入手,为了提高KGF-1的表达量,对KGF-1基因进行改造,根据昆虫偏好密码子的使用规律,同时考虑mRNA的结构对翻译及稳定性的影响进行基因优化。其次,由于KGF-1蛋白的不稳定性,根据现有的报道对KGF-1蛋白的N-端氨基酸进行截短,设计3种形式的KGF-1蛋白的病毒载体,并对其天然的信号肽序列在昆虫细胞反应器中发挥的功能进行分析；此外,IC-BEVS系统是瞬时裂解表达系统,蛋白表达条件及收获时间直接影响重组蛋白的质量和产量。因此,对不同形式的rhKGF-1蛋白的表达条件进行优化,并利用KGF-1具有肝素亲和特性进行纯化；最后,对重组的rhKGF-1蛋白的活性进行研究,进行体外活性实验,通过MTT法对rhKGF-1蛋白促HaCat细胞和BaF3细胞的增殖进行研究；体内活性实验通过对急性肝损伤的保护进行验证,并探讨其不同形式的KGF-1蛋白活性的异同。通过对上述内容的研究,得到以下结论：1.3种形式的KGF-1基因经昆虫偏好密码子优化后在昆虫细胞中均得到表达（即rhKGF-1194, rhKGF-1163, rhKGF-1140）,但表达方式略有不同。KGF-1天然的信号肽可以在昆虫细胞中发挥作用,帮助蛋白分泌到胞外,缩短了rhKGF-1194蛋白的表达时间。2.不同MOI转染细胞对细胞毒害及蛋白产量均有显着影响,不同的收获时间对细胞的产量存在显着影响。最佳的MOI值约在1-3之间,胞内表达在84-96h收获,分泌表达条件下在48-60h收获最佳。3.3种不同形式的目的蛋白稳定性有差异,rhKGF-1140的稳定性好于rhKGF-1194和rhKGF-1163,rhKGF-1194和rhKGF-1163在储存过程中出现降解,从20kDa均降到17kDa左右,大小与rhKGF-1140相接近。4.纯化后的蛋白都具有促细胞有丝分裂活性,其中rhKGF-1140的活性优于rhKGF-1194和rhKGF-1163。5.rhKGF-1对急性肝损伤的保护作用。3种形式的rhKGF-1蛋白对小鼠急性肝损伤均有保护作用,其中rhKGF-1140蛋白的作用最明显,而rhbFGF对小鼠急性肝损伤有保护作用但效果不明显；同时,体外实验表明：rhKGF-1对CC14诱导的HL7702肝细胞损伤有保护作用,初步判断其保护作用是通过减少细胞坏死和抑制细胞凋亡来实现的。通过本研究初步建立昆虫细胞表达rhKGF-1蛋白的表达优化条件,可以认为rhKGF-1在昆虫细胞反应器中表达是可行的,同时也发现rhKGF-1在纯化和储存过程中不稳定发生降解的问题。本论文的研究为大规模利用昆虫细胞生产rhKGF-1蛋白奠定了基础。但是,由于本研究的条件优化仅限于小规模摇床表达,在使用wave或发酵罐进行放大规模表达时还需要进一步对细胞密度、溶氧、pH值、培养基营养等条件进行摸索,尤其是培养基的成本非常高,据报道自制新型的无血清培养基会大大的降低生产成本10-20倍,所以,实现大规模生产hKGF-1还需要进一步深入和系统的研究。
袁志刚[6]（2012）在《腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因抑制PVR的研究》文中指出目的通过建立兔增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy, PVR）动物模型,探讨腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因对PVR增生的抑制作用及机制,评价其治疗PVR的效果。方法1.PVR动物模型的建立：青紫蓝兔28只,随机分成两组,实验组及对照组各14只。实验组采用玻璃体腔注射人富含血小板血浆（Platelet-rich plasma,PRP）联合巩膜外冷冻建立PVR模型,对照组采用玻璃体腔注射兔PRP建立PVR模型。行间接眼底镜、B型超声及HE染色检查,观察PVR程度及视网膜脱离的发生情况。2.p21WAF1/CIP1在PVR发病机制中的作用：青紫蓝兔27只,随机分成两组,正常组3只,实验组24只。正常组不做任何处理；实验组每只兔随机选取一只眼作为实验眼,采用玻璃体腔注射人PRP联合巩膜外冷冻建立PVR模型。行蛋白免疫印迹（Western blot, WB）和逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）,检测PVR模型建立后第7d、14d、21d及28d视网膜组织中p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白及mRNA的表达。3.体外实验：体外培养hRPE407细胞,细胞同步化后,分为磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution, PBS）组、阴性对照（adenovirus mediated delivery of non-target control, Ad-NC）组和腺病毒p21WAF1/CIP1载体转染（adenovirus mediated delivery of p21WAF1/CIP1, Ad-p21）组。行WB和RT-PCR检测p21WAF1/CIP1、CDK、cyclin E蛋白及mRNA在细胞中的表达；行3-甲基-2-噻唑硫酮（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT）试验、流式细胞仪及Transwell检查。4.体内实验：青紫蓝兔50只,随机分成4组,正常对照组2只,PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组各16只。其中PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组按照前述方法建立PVR模型。正常组不做任何处理,PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组于建模后第7d玻璃体腔分别注入PBS、Ad-NC及Ad-p215ul。第14d时,行WB和RT-PCR检测p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白及mRNA在视网膜组织中的表达。行间接眼底镜、B型超声及HE染色,观察第28d各组PVR程度及视网膜脱离的发生情况。结果1.建模后观察28d,实验组20眼均发生了视网膜脱离,发生率为100%；对照组,13眼发生了视网膜脱离,发生率为65%,两组差异有统计学意义（P<0.01）。2. WB和RT-PCR检测结果显示,PVR模型建立后7d、14d、21d及28d视网膜组织内p21WAF1/CIP蛋白及mRNA表达水平均低于正常组,第14d时表达最低（P<0.01）,而CDK2、cyclin E表达均高于正常组,在第14d时表达水平最高（P<0.01）3.WB和RT-PCR检测结果显示在Ad-p21组,p21WAF1/CIP蛋白和mRNA的表达均增高,说明腺病毒成功介导p21WAF1/CIP基因转染人视网膜色素上皮细胞,并稳定表达。MTT检测细胞转染p21WAF1/CIP基因48h后其增生抑制率达到43.13%,较其它组细胞生长速度减慢。细胞周期检测结果显示,Ad-p21组处于G0/G1期的细胞所占百分比显着高于PBS及Ad-NC组（P<0.01）。Transwell小室检测结果显示Ad-p21组穿膜细胞数,明显低于PBS及Ad-NC组（P<0.01）。4.间接眼底镜及B超结果显示PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组第28d视网膜脱离的发生率分别为100%、91.67%和33.33%。建模后第14d时,WB和RT-PCR显示Ad-p21组p21WAF1/CIP1蛋白及mRNA的表达显着高于正常组、PBS组及Ad-NC组（P<0.01）,而CDK2、cyclin E表达明显低于其它组（P<0.01）。结论1.采用玻璃体腔注射人PRP联合巩膜外冷冻可成功建立了PVR动物模型,视网膜脱离的发生率为100%。2.p21WAF1/CIP1基因在PVR发病机制中可能起着重要作用。3.腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因能有效抑制人视网膜色素上皮细胞的增生及迁移。4.腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因可有效减轻PVR程度,并降低视网膜脱离发生率。
邱晓頔[7]（2012）在《白内障患者诱导性多能干细胞（iPS）的建立及其定向分化的研究》文中进行了进一步梳理年龄相关性白内障（age-related cataract, ARC）为全球致盲眼病的主要原因。在我国约有250万人因白内障致盲,占全球白内障致盲总数的10%。随着人口的老龄化,预计我国每年新增白内障患者将超过100万,而我国的白内障年手术量尚不足以解决每年的新增例数。因此,我国的白内障盲防治问题十分严峻。而先天性白内障是指出生前即存在,或出生后才逐渐形成的先天遗传或发育障碍的白内障,超过1/3的患者是遗传所致。任何参与、影响晶状体发育的基因突变都可能导致先天性白内障的发生。因此,明确先天性白内障的发病机制对于治疗及预防先天性白内障的发生发展具有重要的意义。白内障摘除联合人工晶状体（intraocular lens, IOL）植入是目前治疗白内障最常用且效果较为理想的方法,而后囊膜混浊（posterior capsular opacification, PCO）是影响病人术后远期视力预后的最常见的并发症,其术后5年的发生率高达30%左右。虽然可以利用激光或者手术切开混浊的后囊膜,但是却增加了病人的经济负担,并会带来新的并发症。所以如何预防PCO的发生是眼科医生和病人都比较关注的一个问题。体细胞诱导成为多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）的研究成果被国际生命科学界誉为具有里程碑意义的创新之举。多能干细胞能够自我更新,能在体内外分化成几乎所有类型的细胞,在再生医学等方面有巨大的应用潜力,具有极高的理论研究价值。通常用来源于囊胚期胚胎的内细胞团的胚胎干细胞、通过核移植得到的胚胎干细胞以及在成体细胞中转入外源转录因子得到的iPSCs,进行体细胞重编程研究。在短短数年的时间里,此项研究已经在细胞重编程的机理研究、探索疾病的发生发展机制以及临床医学的应用等领域引发了很多突破性的进展；而且这一非克隆干细胞技术的诞生,成功地避开了长期以来争论不休的伦理问题,极大地推动该领域和相关科学领域的发展。与胚胎干细胞研究相比,体细胞重编程技术可以为更多的患者提供特异性多能干细胞。因而,在医学应用方面（例如器官培养和器官移植等）有广阔的前景。患者特异性的多能干细胞的建立能够为疾病发病机制的研究、治疗药物的筛选及细胞移植治疗提供有力的工具。采用慢病毒载体将外源性转录因子导入白内障患者晶体上皮细胞,从而获得诱导性多能干细胞。白内障患者来源的多能干细胞的建立,能够为晶体发育、细胞分化、衰老提供便利的细胞模型,同时可为白内障治疗药物的筛选及白内障发病机制的研究提供有力的研究工具。第一部分原代人晶体上皮细胞的体外培养目的对正常人晶体、年龄相关性白内障晶体上皮细胞及人皮肤成纤维细胞进行体外培养,并观察体外培养的晶体上皮细胞及皮肤成纤维细胞的生物学特性及组织学变化。方法正常人晶体上皮细胞培养取材于角膜移植术后供体眼的晶状体囊膜,年龄相关性白内障晶体上皮细胞培养取材于白内障超乳手术中撕除的晶体前囊膜。角膜移植术后供体眼的晶状体沿赤道部后方约2mm环形剪开后囊膜,小心取下完整的前囊膜和赤道部囊膜,剪成1mm×1mm大小的组织块,利用组织块贴片法,进行原代人晶状体上皮细胞的培养。白内障晶体前囊膜在超乳手术中完整取材、洗去粘弹剂之后剪成1mm×1mm大小的组织块,利用组织块贴片法进行培养。使用0.25%胰酶溶液对融合后的细胞进行消化传代。取年龄相关性白内障患者的皮肤组织,剪成1mm3大小的组织块,过夜消化,离心收集细胞,经多次传代后,获得较为纯化的皮肤成纤维细胞进行培养。在倒置相差显微镜下对三种细胞进行形态学观察。采用CCK-8法连续7天测定三种细胞的增殖速率,绘制生长曲线并进行比较。结果正常人晶体囊膜组织块贴壁48～72小时后可见人晶状体上皮细胞从组织块边缘长出,约10～15天达到融合。初期正常人晶体上皮细胞为多角形,胞体透亮,细胞边界清晰。融合后的细胞具有上皮细胞的形态特征,为典型的六角形或多边形。在体外细胞可传五代,但第三代以后细胞表型向成纤维细胞转化。第三代以后正常人晶体上皮细胞胞体呈梭形或长条形。第五代正常人晶体上皮细胞老化,胞浆内出现大小不等的空泡样改变,最后崩解死亡。白内障患者晶体上皮细胞形态与增殖能力与正常晶体上皮细胞相类似,但部分白内障晶体上皮细胞与正常人晶体上皮细胞形态差异较大,更接近成纤维细胞,且细胞在第一次传代后即老化崩解。人皮肤成纤维细胞伸展呈梭形或多边形,在经过多次培养传代后,可得到较为纯化的成纤维细胞。CCK-8法绘制的生长曲线表明人皮肤成纤维细胞具有最高的增殖速率,白内障患者的晶体上皮细胞增殖最慢。结论利用组织块贴片法进行人晶状体上皮细胞培养,操作简单,成功率高。第二代人晶状体上皮细胞是进行细胞学及相关研究比较理想的实验对象。正常人晶体上皮细胞具有较好的生长及增殖能力,而白内障晶体上皮细胞增殖力差、细胞形态不佳。人皮肤成纤维细胞在消化离心后经过多次传代能够获得纯化的成纤维细胞。人皮肤成纤维细胞增殖最快,正常人晶体上皮细胞增殖速率居中,白内障患者晶体上皮细胞增殖速率最慢。第二部分白内障患者诱导性多能干细胞的建立目的分别构建表达OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒载体（Lentivirus）,并转染年龄相关性白内障患者体外培养的晶体上皮细胞,诱导建立患者来源的诱导性多能干细胞,与同一患者来源的皮肤成纤维细胞对比,观察限定因子对于诱导多能干细胞的诱导效率。方法选择3例诊断为年龄相关性白内障的患者,取其晶体前囊膜及皮肤组织进行体外培养。白内障晶体前囊膜在超乳手术中完整取材、洗去粘弹剂之后剪成lmm×lmm大小的组织块,利用组织块贴片法进行培养。使用0.25%胰酶溶液对融合后的细胞进行消化传代。取上述3例年龄相关性白内障患者的皮肤组织,剪成Imm3大小的组织块,过夜消化,离心收集细胞,经传代后,获得较为纯化的皮肤成纤维细胞进行培养。分别将含有OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒载体质粒（plenti-hOCT4/plenti-hSOX2/plenti-hKLF4）同辅助质粒（pCMV-gag-pol-PA/pCMV-VSVg）一起共感染293T细胞,重组包装构建慢病毒载体（分别为Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4）.将构建的三种慢病毒载体混合分别感染第2代的白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞,培养5天后,与小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEFs）进行共培养,直至出现iPSCs。采用碱性磷酸酶（ilkaline phosphatase, AKP）染色比较白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞诱导生成iPSCs的效率差异。同时培养人H9胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）进行对照。结果利用组织块贴片法培养的白内障患者晶体上皮细胞及消化法培养的人皮肤成纤维细胞形态与增殖能力较好,第2代细胞适用于进行慢病毒感染。构建的慢病毒载体enti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效转染两种细胞,并不影响细胞的状态及增殖能力。在慢病毒载体转染后第5天,将白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞分别与MEFs进行共培养,在转染后第12天开始出现与ESCs形态相似的细胞克隆。细胞克隆碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AKP）染色阳性,说明已成功诱导出iPSCs。采用AKP染色各比较3例患者的白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞诱导生成iPSCs的效率差异,在1×106的细胞接种密度下,白内障晶体上皮细胞平均可生成27.7个AKP阳性的细胞克隆,而人皮肤成纤维细胞平均仅生成15个细胞克隆。白内障晶体上皮细胞诱导形成的iPSCs细胞克隆与ESCs在细胞形态上具有相似性。结论构建的慢病毒载体Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效转染白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞,并成功诱导出与ESCs形态相似、AKP染色阳性的iPSCs,且白内障晶体上皮细胞与人皮肤成纤维细胞相比具有更高的iPSCs诱导效率。第三部分白内障患者诱导性多能干细胞的鉴定目的对诱导建立的白内障患者来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）进行鉴定,检测细胞的分子标记及体内外分化能力,评价其多能性。方法对已成功诱导的白内障患者来源的iPSCs进行多能性鉴定：基因表达、免疫荧光染色分析、RT-PCR检测、体外分化拟胚体、体内分化畸胎瘤检测。提取iPSCs、ESCs和白内障患者晶体上皮细胞的总RNA采用HG-U133-2array （Affymetrix）对三种细胞的全基因表达谱进行检测并进行对比。提取iPSCs、 ESCs和白内障患者晶体上皮细胞的总RNA, RT-PCR检测人ESCs标志性基因（Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2、VIMENTIN）表达。采用细胞免疫组化荧光（immunohistochemistry, ICH）检测人ESCs标志性抗原（SSEA-3、SSEA-4、Nanog、 TRA-60、TRA-81、OCT-4）的表达。将iPSCs悬浮培养观察拟胚体（embryoid body,EB）形成,并在培养基中添加特殊成分（BMP4, FBS, retinoic acid （RA））观察EB的体外分化。将iPSCs接种至裸鼠皮下,观察畸胎瘤形成及体内分化情况。结果基因表达谱的分析结果显示,iPSCs与ESCs（?）（?）基因表达谱极为相似,但与白内障患者晶体上皮细胞的基因表达谱有较大差异。我们选择了1例56岁的年龄相关性白内障患者的iPSCs,并随机选择其中4个细胞克隆（分别命名为iPS1、iPS2、iPS3、iPS4）进行检测。RT-PCR检测的结果显示,iPS1与ESCs的ESCs标志性基因Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2和VIMENTIN的表达最为相似,而其他3株克隆与ESCs存在一定的差异。对iPS1进行ICH检测显示,人ESCs标志性抗原（SSEA-3、SSEA-4、Nanog、TRA-60、TRA-81、OCT-4）在iPS1中明显表达。体外分化拟胚体的结果显示,EB的分化使得Nanog和OCT-4表达下调,培养基中分别添加BMP4、FBS、RA之后,外胚层标志性基因NACM、TH和GFAP/内胚层标志性基因amylase、SOX7和AFP/中胚层标志性基因PECAM、desmin和SCL在EB中的表达均出现了不同程度的上调表达。对EB细胞进行ICH检测结果显示,EB细胞表达中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、外胚层标志物β-微管蛋白（tubulin beta1, Tuj-1）和内胚层标志物甲胎蛋白（α-fetoprotein, AFP）。体内分化畸胎瘤的结果显示,裸鼠注射iPSCsl个月左右可在裸鼠注射部位见肿块形成,2个月后摘除肿瘤进行组织切片检查,镜下可见三个胚层的组织细胞。结论研究诱导的iPSCs在基因表达谱、ICH、RT-PCR检测、体内外分化能力方面与ESCs极为相似,建立的iPSCs具有与ESCs相同的多向分化能力。第四部分白内障患者诱导性多能干细胞向晶体前体细胞的分化诱导目的探讨利用诱导因子三步法将白内障患者来源的多能干细胞诱导为晶体前体细胞的方法,评价分化细胞与晶体细胞的相似性。方法对已成功诱导的白内障患者晶体上皮细胞来源的iPSCs及ESCs进行三步法的分化诱导：在细胞培养基中添加（1）第0～5天100ng/ml Noggin;（2）第5～15天100ng/ml bFGF、20ng/ml BMP4和20ng/ml BMP7;（3）第15～30天100ng/ml FGF2和20ng/ml Wnt-3a.每5天提取iPSCs和ESCs的RNA, RT-PCR检测晶体细胞分化标志基因PAX6、SCX2、SIX3、CRYAB、CRYAA、BFSP1和MIP表达情况,并绘制变化曲线。采用ICH检测分化过程中晶体细胞分化标志PAX6、α晶体蛋白和β-晶体蛋白的表达。提取iPSCs、ESCs和人晶体的总蛋白,Western-blot法检测晶体细胞分化标志PAX6、α-晶体蛋白和β-晶体蛋白的表达水平并进行比较。取3例人晶状体,分别为22岁、44岁和65岁,提取总蛋白,并提取白内障患者晶体上皮细胞来源的iPSCs、人皮肤成纤维细胞来源的iPSCs及ESCs的总蛋白,Western-blot法检测间隙连接蛋白43（connexin43）和纤维连接蛋白（fibronectin）,以评价其上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transitions, EMT）的程度。结果经过三阶段诱导因子的作用后,对发生分化的iPSCs和ESCs进行的RT-PCR检测显示,PAX6、CRYAB、CRYAA、BFSP1和MIP的表达持续上升,SOX2的表达持续下降,SIX3的表达则是先上升后下降。ICH检测的结果显示分化过程中,iPSCs出现了晶体细胞分化标志PAX6、α-晶体蛋白和β-晶体蛋白的持续表达。Western-blot的结果显示,iPSCs、ESCs和人晶体中均有PAX6、α-晶体蛋白和β-晶体蛋白的表达,但ESCs的蛋白表达水平相对较低。EMT评价的结果显示,connexin43在22岁晶体中表达量最高,随着年龄的增加而明显降低,fibronectin则随着年龄的增加表达量逐渐增高；而在白内障患者晶体上皮细胞来源、人皮肤成纤维细胞的iPSCs及ESCs诱导分化的细胞中,connexin43在白内障患者来源的细胞中表达量最高,而fibronectin（?）勺表达相似。结论三阶段诱导因子的组合作用能够成功诱导出晶体前体细胞,且诱导分化的细胞能够稳定表达晶体细胞的标志性基因及蛋白。白内障患者晶体上皮细胞来源的iPSCs（?）比人皮肤成纤维细胞来源的iPSCs及ESCs具有更低的EMT程度。
吕自力[8]（2011）在《奶牛体细胞的纯化与人COL1α1 cDNA转染及核移植胚胎发育研究》文中指出乳腺生物反应器（mammary gland bioreactor）,或称动物个体乳腺表达系统,是指利用乳腺特异表达的乳蛋白基因调控序列构建表达载体,制作转基因动物,指导特定外源基因在动物乳腺中特异、高效率地表达,以期从分泌乳汁中获得外源活性蛋白。它具有产量高、生产成本低、易于纯化和产品活性高等优势。目前利用转基因乳腺生物反应器生产的药物蛋白有不少已经成功应用于临床治疗等多种相关领域。利用转基因克隆技术可以把对基因筛选的过程提前到细胞水平,保证出生的克隆个体是转基因动物。在高等动物体内,胶原广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼、内脏的间充质细胞及肌腔、韧带、巩膜等部位,角膜几乎完全由胶原蛋白组成。胶原是结缔组织及其重要的结构蛋白,起支撑器官、保护机体的功能,是决定结缔组织韧性的主要因素。胶原蛋白因具有高生物活性和低免疫原性,在医药、医疗、美容、食品领域被广泛应用。人源性胶原蛋白对人类更为重要和安全,但由于伦理和道德的限制不能直接获得,所以把人的胶原蛋白利用乳腺生物反应器的方法生产十分必要且安全可行。利用乳腺生物反应器生产人类胶原蛋白,首先要获得人胶原蛋白基因,并把此基因引入有效的乳腺表达载体中。其次把构建的载体通过适当的转基因方法转入靶细胞,从阳性靶细胞中获得可以无限扩增、遗传稳定的单细胞克隆系,并以此细胞为核移植供体细胞,利用核移植技术获得阳性胚胎,以期在此基础上最终获得阳性个体。为了获得携带有目的基因的乳腺表达载体,并考虑到表达出来的融合蛋白能进行有效提纯及对阳性细胞能进行有效的筛选,实验首先从人的包皮组织中提取mRNA,反转录获得人胶原蛋白cDNA片段,在cDNA的3’端连接上了6×His蛋白分离标签。然后以pBC1质粒为基础质粒,以β-casein启动子为调控元件,通过表达质粒的改造,构建了人Ⅰ型α1胶原cDNA基因乳腺特异性表达载体。最后,再分别将绿色荧光蛋白（EGFP）和新霉素抗性基因（Neor）作为双标记基因引入表达载体,完成了乳腺特异表达载体的改造和构建。合成的cDNA片段经过测序,Blast结果表明,获得的中国人的Ⅰ型α1胶原cDNA基因与Gene Bank中公布的相应基因序列一致。对构建的载体进行了PCR片段扩增分析,结果显示,构建的载体结构完整、无缺失。为了获得有效转染的单细胞克隆系,实验首先建立了成纤维细胞、卵丘颗粒细胞和输卵管上皮细胞系,并对这些靶细胞进行了脂质体转染和电穿孔转染实验,对转染的阳性细胞进行G418筛选并结合绿色荧光的表达对阳性细胞进行单细胞克隆的扩增培养。结果,用脂质体转染法对三种靶细胞进行转染后,成纤维细胞与卵丘颗粒细胞获得了成功转染,输卵管上皮细胞未能获得成功。之后对输卵管上皮细胞进行了电穿孔转染,通过一系列实验条件优化组合后,最后在90 mOsmo/kg低渗缓冲液、800V电压（2mm电穿孔管）下获得了20.8%的转染效率。通过对三种细胞进行G418耐受检测,得出了一致的检测结果,即三种细胞在G418浓度为800μg/mL左右时,能有效筛选出阳性细胞。获得初步筛选的细胞采用在绿色荧光下定位提取的方法将来自单细胞的阳性克隆细胞群进行了扩大,最后三种靶细胞都得到了遗传背景一致的单细胞克隆系。在实验中还发现,卵丘颗粒细胞在进行小分子量载体转染时能获得比大分子载体好的转染效果,成纤维细胞转基因细胞系的生长速度较非转基因的要慢3d左右。为了解在核移植中作为供体的细胞在体外培养时的细胞凋亡情况,用流式细胞术在不同时段对成纤维细胞、卵丘颗粒细胞、输卵管上皮细胞和乳腺上皮细胞进行了细胞凋亡的检测。结果发现,细胞在同一代生长周期中,一旦处于接触抑制或饥饿培养过程中,凋亡速度明显加快,细胞随着培养代数的增加,凋亡率也不断增加。四种测试细胞的凋亡趋势是乳腺细胞凋亡最快,其次是输卵管上皮细胞,卵丘颗粒细胞在15代以前比成纤维细胞凋亡率低,但15代之后却高于成纤维细胞。最后对三种转基因细胞核移植重构胚发育效果进行了比较,发现：1)成纤维细胞不同转基因细胞系之间的胚胎发育率没有显着差异（P>0.05）；2)同种细胞转基因和非转基因细胞作为供体进行核移植重构胚发育,三种转基因细胞的融合率都出现了明显的下降（P<0.05）,但在融合后的发育中,转基因和非转基因细胞在卵裂率和桑椹胚/囊胚率上的差异不明显；3)对三种转基因细胞进行平行比较发现,成纤维细胞和卵丘颗粒细胞的融合率明显比输卵管上皮细胞高,而且差异显着（P<0.05）。但在融合后的桑椹胚/囊胚形成率上,成纤维细胞又明显低于卵丘颗粒细胞和输卵管上皮细胞（P<0.05）。上述结果说明：1)同种细胞不同转基因系之间可能有插入位点和拷贝数的差异,但这种差异对核移植重构胚早期发育没有影响；2)转基因过程和筛选过程对供体细胞的细胞膜结构有一定的影响,造成在融合过程中转基因细胞的融合性差,但转基因细胞一旦与卵母细胞融合,其随后的重构胚发育效果与非转基因细胞相似；3)在融合过程中,输卵管上皮细胞的融合相对于成纤维细胞和卵丘细胞困难,融合后,卵丘细胞和输卵管上皮细胞的早期胚胎发育能力较成纤维细胞强。本文系统地进行了从载体的构建到细胞系的建立、细胞的转染、单细胞克隆系的筛选与扩大到各种转基因细胞的胚胎发育规律的研究,以期为转基因乳腺生物反应器的研究提供有益的参考。
黄海楠[9]（2011）在《狂犬病病毒保护性抗原基因重组伪狂犬病毒/杆状病毒活疫苗的实验研究》文中进行了进一步梳理狂犬病是以恐水、畏光和狂躁等症状为特征的一种古老的人畜共患病。几乎所有温血动物都能感染狂犬病病毒（Rabies virus, RABV）并造成中枢神经系统损伤,形成致死性的脑脊髓炎。在发达国家,通过对犬的严格管理和预防免疫,已基本消除了犬狂犬病,从而有效控制住了人类狂犬病。在中国,犬是狂犬病病毒侵入人群的主要传染源和传播媒介,由犬传播导致人感染的病例约占狂犬病总数的85%-90%。因此,控制犬狂犬病并使人类免受狂犬病病毒的侵害,主要手段仍是犬的常规免疫以及人类的暴露前、暴露后免疫。本研究对兽用狂犬病病毒新型活疫苗进行了新的探索,主要研究内容如下：1.表达狂犬病病毒ERA株和CTN株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-（TK-/gE-/2G+）的构建、鉴定及免疫研究伪狂犬病病毒具有清楚的遗传背景、稳定的遗传特点、广泛的宿主范围、较高的增殖滴度、较大的外源基因插入容量（可容纳至少40kb）及不感染人等优点。因此本研究以伪狂犬病病毒Ea株的TK-/gE-/LacZ+变异株为载体构建重组病毒PRV-（TK-/gE-/2G+）,并经PCR、southern blot和western blot鉴定正确。重组病毒免疫Balb/c小鼠,首免后3周就能检测到针对糖蛋白的ELISA抗体,二免后2周ELISA抗体有所升高但差异不显着,MTS的结果显示重组病毒激发机体产生了较高的细胞免疫,但未检测到狂犬病病毒中和抗体。重组病毒免疫犬,犬很敏感,均在两周内死亡,表明该致弱的伪狂犬病病毒载体对犬的安全性有待商榷。2.表达狂犬病病毒SRV9株核蛋白和糖蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-（Bartha-SN-SG）的构建、鉴定及免疫研究基于前期的伪狂犬病病毒对犬的安全性的考虑,改用天然致弱,后期缺失毒力因子gG的伪狂犬病病毒Bartha-gG-/EGFP+株为载体构建重组病毒PRV-（Bartha-SN-SG）,并经荧光显微镜观察、PCR和western blot鉴定构建正确。重组病毒免疫Balb/c小鼠,首免后3周能检测到针对糖蛋白的ELISA抗体,二免后2周ELISA抗体升高但差异不显着,MTS的结果显示重组病毒激发了较高的细胞免疫,但中和抗体均为阴性。重组病毒以105TCID50免疫犬,免疫原性略差,中和抗体均为阴性,但该致弱重组病毒未对犬表现出致病性。3.表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白的重组杆状病毒BV-VSV/G-G的构建、鉴定及免疫研究研究发现杆状病毒不能感染哺乳动物细胞,但是可以进入多种哺乳动物细胞中,通过合适的哺乳动物启动子表达外源基因,自身的基因组并不复制和表达,但是哺乳动物血清中的补体系统能抑制杆状病毒。已有研究发现膜上展示有水泡性口炎病毒融合糖蛋白（VSV-G）的杆状病毒粒子对补体系统有极强的耐受性,并能利用VSV-G的融合作用介导细胞间的融合。因此本研究构建了表面展示有VSV-G的表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白的重组杆状病毒并对所构建的重组病毒进行免疫效力研究。重组病毒免疫ICR小鼠,首免后3周和二免后2周ELISA抗体及MTS刺激指数均超过伪狂犬重组病毒,二免后两周可检测到狂犬病病毒中和抗体（VNA>0.5 IU/mL）,最高可达10.26 IU/mL,并呈剂量依赖性。重组杆状病毒免疫犬,均能产生中和抗体（VNA>0.5 IU/mL）,但中和抗体水平个体差异比较大。获得的三株重组病毒做比较,表明重组杆状病毒作为RABV候选疫苗株更具有良好的应用前景。
许燕[10]（2007）在《超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的实验研究》文中指出脉络膜新生血管（CNV）是很多眼底疾病的共同病理过程,大多病例会转化为不可逆的盲,是视力预后极差的象征。虽然对它的治疗手段繁多,但存在复杂、昂贵,疗效欠确切等缺点。因此CNV的防治具有极大的意义。目前基因治疗尚处于研究阶段。微泡造影剂作为一种新型的基因载体,在声像图的监控下进行超声辐照,微泡能够在指定部位“爆破”,释放所携带的基因。本文通过体内实验探讨氩绿激光创建Long-Evans大鼠脉络膜新生血管模型的可行性并研究超声微泡造影剂携带EGFP基因对大鼠视网膜进行转染的效率及寻找有效的注射途径。全文分为三个部分,依次对大鼠脉络膜新生血管的形成,以微泡为基因载体与其他转染方法的转染效率对比,将基因载体以不同途径引入体内的转染效率对比作了研究。第一部分是实验性大鼠CVN模型研究。通过对雌性Long-Evans大鼠30只（60只眼,每只大鼠一眼为实验眼,另眼为对照眼）,以波长514.5 nm的氩绿激光（光斑直径50μm,功率0.8W,时间0.05s）,在距视盘2个视盘直径处围绕视乳头进行光凝,来建立CNV模型。分别于光凝后3,7,14,21,28天进行眼底荧光造影。检查后处死动物（6只/次）,摘除眼球取眼后段组织制作石蜡切片,常规HE染色。结果发现光凝后7天出现CNV,21天CNV大量形成,大鼠CNV发生率高（77.08%）;眼底造影、光镜下均有相应改变,FFA表现为视网膜血管无关的荧光素渗漏,光镜下可见到CNV结构。氩绿激光诱导Long - Evans大鼠CNV具有实验方法简便易行,成模时间短,维持时间长,成模率高,病理结构稳定等特点。第二部分是将微泡携带基因的转染效率与其他的转染方法进行了对比。雌性Long-Evans大鼠30只（60只眼）分为6组,以不同的转染方法进行EGFP基因的转染:①单纯超声照射组;②微泡+超声照射组;③裸质粒组;④质粒+超声照射组;⑤质粒+微泡;⑥质粒+微泡+超声照射组。两周后处死大鼠,做石蜡切片HE染色观察视网膜损伤情况,做冰冻切片在激光共聚焦显微镜下观察蛋白表达情况及分析EGFP质粒在大鼠色素上皮层的表达强度。结果显示:第①、②组大鼠视网膜及脉络膜各层组织结构清晰、完整,与正常大鼠组织结构无明显差异。EGFP在各组大鼠的视网膜包括色素上皮细胞层均有表达,第③、④、⑤组荧光强度较弱,第⑥组大鼠的视网膜荧光强度较强。第三部分是通过不同途径将携带EGFP质粒的超声微泡造影剂引入体内,比较两种注射方式的基因转染效率。雌性Long-Evans大鼠10只（20只眼）分为2组,以不同的注射方式将携带EGFP质粒的超声微泡造影剂引入体内:①尾静脉注射组;②球周注射组。两周后处死大鼠做冰冻切片,在激光共聚焦显微镜下观察蛋白表达情况及分析EGFP质粒在大鼠色素上皮层的表达强度。结果显示:EGFP在两组大鼠的视网膜包括色素上皮细胞层均有表达,且荧光强度均较强。本实验探讨创建Long-Evans大鼠脉络膜新生血管模型的可行性并研究超声微泡造影剂携带EGFP基因对大鼠视网膜进行转染的效率及寻找有效的注射途径。然而CNV的基因治疗尚处于起步阶段,真正应用于临床需更进一步的研究。
二、杆状病毒介导LacZ基因转染体外培养的人虹膜色素上皮细胞(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、杆状病毒介导LacZ基因转染体外培养的人虹膜色素上皮细胞(英文)（论文提纲范文）
（1）猪γ干扰素与猪α干扰素扩大培养工艺优化（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 干扰素分类 |
| 1.2 干扰素的作用的机制 |
| 1.3 干扰素的作用 |
| 1.4 干扰素的临床应用 |
| 1.5 杆状病毒载体(BEV) |
| 1.5.1 杆状病毒表达系统(Baculovirus expression system BES) |
| 1.5.2 昆虫细胞的发展 |
| 1.5.3 昆虫细胞的优势 |
| 1.5.4 IC-BEVS优势 |
| 1.5.5 杆状病毒载体表达系统在蛋白质功能方面的应用 |
| 1.5.6 杆状病毒载体表达系统在疫苗上的应用 |
| 1.5.7 杆状病毒表达载体系统在病毒功能方面的研究 |
| 1.6 杆状病毒表达载体的展望 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞及毒株 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 抗病毒活性检测的准备 |
| 2.2.2 抗病毒活性的检测 |
| 2.2.3 干扰素在摇瓶中的扩增 |
| 2.2.4 干扰素的储存条件摸索 |
| 2.2.5 干扰素中杆状病毒的灭活 |
| 3 结果 |
| 3.1 VSV病毒的繁殖 |
| 3.2 猪干扰素重组杆状病毒种毒的制备 |
| 3.3 干扰素扩大培养的工艺优化 |
| 3.3.1 SF9 细胞在摇瓶中的最佳培养密度 |
| 3.3.2 重组杆状病毒不同接毒量对于SF9 细胞的影响 |
| 3.3.3 重组杆状病毒接毒量为200μL时不同时间点对干扰素抗病毒活性的影响 |
| 3.3.4 重组杆状病毒接毒量为400μL时不同时间点对干扰素抗病毒活性的影响 |
| 3.3.5 重组杆状病毒接毒量为2 mL时不同时间点对干扰素抗病毒活性的影响 |
| 3.3.6 重组杆状病毒接毒量为4 mL时不同时间点对干扰素抗病毒活性的影响 |
| 3.3.7 重组杆状病毒接毒量为6 mL时不同时间点对干扰素抗病毒活性的影响 |
| 3.3.8 重组杆状病毒接毒量为8 mL时不同时间点对干扰素抗病毒活性的影响 |
| 3.3.9 重组杆状病毒接毒量为12 mL时不同时间点对干扰素抗病毒活性的影响 |
| 3.4 干扰素中杆状病毒灭活条件的摸索 |
| 3.4.1 β-丙内酯(BPL)对于抗病毒效价的影响 |
| 3.4.2 甲醛溶液(FA)对于抗病毒效价的影响 |
| 3.4.3 BPL与 FA溶液灭活对SF9 细胞的影响以及灭活效果检验 |
| 3.5 干扰素储存条件的摸索 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文情况 |
（2）Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复兔关节软骨损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人脐带干细胞定向诱导分化软骨细胞的实验研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二部分 过表达Bcl-x L基因慢病毒载体对人脐带血干细胞的调控机理研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 海藻酸钠支架负载人脐带血干细胞复合物移植治疗兔关节软骨损伤 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间发表的论文与成果 |
| 致谢 |
| 综述一 Bcl-x L 基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 干细胞定向诱导分化成软骨细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）鸡输卵管组织特异性启动子克隆及功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 输卵管生物反应器的概念和原理 |
| 1.2 家禽生殖系统特征 |
| 1.3 家禽卵清蛋白 |
| 1.3.1 卵清蛋白基因结构 |
| 1.3.2 卵清蛋白基因的表达调控 |
| 1.4 卵清蛋白启动子研究进展 |
| 1.5 输卵管生物反应器研究进展 |
| 1.6 输卵管生物反应器的优势 |
| 1.7 输卵管生物反应器的应用 |
| 1.8 存在的问题和展望 |
| 1.9 本研究目的和意义 |
| 第二章 卵清蛋白启动子克隆及细胞水平评价 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 实验动物和细胞 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 生物信息学分析 |
| 2.1.6 引物设计 |
| 2.1.7 鸡输卵管组织特异性表达载体的构建 |
| 2.1.8 原代鸡输卵管细胞的制备和转染 |
| 2.1.9 CHO细胞的培养和转染 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 启动子区克隆和鸡输卵管组织特异性表达载体的构建结果 |
| 2.2.3 原代鸡输卵管细胞的培养和转染结果 |
| 2.2.4 CHO细胞转染结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 增强子元件对卵清蛋白启动子调控表达效率的影响 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 实验动物和细胞 |
| 3.1.2 菌种和质粒 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 引物设计 |
| 3.1.5 鸡输卵管组织特异性表达载体的构建 |
| 3.1.6 OV启动子驱动GFP在CHO细胞中的表达 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 鸡输卵管组织特异性表达载体的构建 |
| 3.2.2 OV启动子驱动GFP在CHO表达 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 卵清蛋白启动子驱动HA蛋白在CHO细胞表达 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 毒株和细胞 |
| 4.1.2 菌种和质粒 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 引物设计 |
| 4.1.5 表达HA蛋白鸡输卵管组织特异性载体的构建 |
| 4.1.6 HA蛋白在CHO细胞中的表达与检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 鸡输卵管组织特异性表达载体的构建结果 |
| 4.2.2 HA蛋白在CHO细胞中的表达与检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 溶菌酶信号肽对外源蛋白分泌表达的影响 |
| 5.1 材料方法 |
| 5.1.1 细胞 |
| 5.1.2 菌种和质粒 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 引物设计 |
| 5.1.5 分泌型表达载体的构建 |
| 5.1.6 GFP在CHO细胞中的表达 |
| 5.1.7 Western-blot |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 鸡输卵管组织特异性表达载体的构建结果 |
| 5.2.2 GFP在CHO细胞的表达 |
| 5.2.3 Western-blot结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）鸭甲肝病毒1型一个保守的中和性线性B细胞表位的确定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 鸭甲肝病毒的研究概述 |
| 1.1.1 DHAV-1病原学研究 |
| 1.1.2 流行病学研究 |
| 1.1.3 DHAV分子生物学的研究 |
| 1.1.4 临床症状和病理剖检 |
| 1.1.5 DHAV的诊断方法 |
| 1.1.6 DHAV的预防与治疗 |
| 1.2 昆虫杆状病毒表达系统 |
| 1.2.1 杆状病毒基因组的结构及功能的研究 |
| 1.2.2 杆状病毒表达系统的特点 |
| 1.2.3 杆状病毒载体的重组与筛选 |
| 1.2.4 影响外源基因表达的因素 |
| 1.2.5 杆状病毒载体及其表达系统进展 |
| 1.2.6 昆虫细胞系及培养基 |
| 1.2.7 杆状病毒表达的最新应用及展望 |
| 1.3 原核表达系统 |
| 1.4 抗原表位的研究 |
| 1.4.1 T细胞表位的研究方法 |
| 1.4.2 B细胞表位的研究方法 |
| 1.4.3 抗原表位的应用及展望 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌(毒)株 |
| 2.1.2 实验动物和细胞株 |
| 2.1.3 酶和相关试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 实验所用的溶液及其配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试验一 单克隆抗体的制备 |
| 2.2.2 试验二 杆状病毒表达系统对单克隆抗体的抗原表位进行初步分析 |
| 2.2.3 试验三 用原核表达系统采用设计引物交叉重叠法分段表达VP1蛋白确定出抗原表位 |
| 2.2.4 试验四 杆状病毒表达系统IFA分析验证抗原表位 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 单克隆抗体的制备 |
| 3.1.1 细胞株分泌抗体稳定性检测 |
| 3.1.2 腹水效价的测定 |
| 3.2 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达BVP1蛋白同5株单抗的抗原表位初步分析结果 |
| 3.2.1 pFastBac~(TM) HTB-VP1重组质粒的双酶切鉴定 |
| 3.2.2 重组转移载体的克隆测序 |
| 3.2.3 重组杆粒的鉴定 |
| 3.2.4 重组病毒感染sf9细胞后的细胞病变 |
| 3.2.5 重组蛋白在sf9中的表达及IFA分析 |
| 3.2.6 Weatern blot分析结果 |
| 3.3 第一次VP1蛋白分7段交叉表达 |
| 3.3.1 PCR扩增结果 |
| 3.3.2 DHAV-VP1分7段基因重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.3.3 SDS-PAGE凝胶分析 |
| 3.3.4 Western blot分析结果 |
| 3.4 第二次VP1蛋白分6段交叉重叠表达 |
| 3.4.1 PCR扩增图 |
| 3.4.2 DHAV-1VP1分6段基因重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.4.3 重组质粒的克隆测序 |
| 3.4.4 重组蛋白诱导表达SDS-PAGE鉴定 |
| 3.4.5 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.4.6 单克隆抗体4F8抗原表位的Wertern blot鉴定 |
| 3.5 单克隆抗体4F8识别抗原表位的IFA验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DHAV-1抗原表位的研究现状 |
| 4.2 DHAV-1蛋白的真核表达及5株单抗识别抗原的初步定位 |
| 4.3 单抗4F8识别抗原表位的精确定位 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 攻读硕士期间发表论文情况 |
（5）角质细胞生长因子-1（KGF-1）在昆虫细胞中的表达及其活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 ：前言 |
| 1.1 KGF-1研究进展 |
| 1.1.1 KGF-1概述 |
| 1.1.2 KGF-1药理学活性 |
| 1.1.3 KGF-1病理活性 |
| 1.1.4 KGF-1工程化研究 |
| 1.1.5 安全性和毒性研究 |
| 1.1.6 应用 |
| 1.2 昆虫细胞表达系统的研究现状 |
| 1.2.1 昆虫细胞培养 |
| 1.2.2 昆虫细胞生物反应器培养 |
| 1.2.3 杆状病毒载体的改进 |
| 1.2.4 昆虫细胞杆状病毒表达系统的现状 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 ：KGF-1基因优化及病毒载体构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 目的基因优化 |
| 2.2.2 转移载体构建 |
| 2.2.3 穿梭载体构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 序列改造前后序列比对 |
| 2.3.2 转移载体及穿梭载体的构建 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 ：KGF-1的表达及纯化 |
| 3.1 材料与设备 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组杆状病毒的获得 |
| 3.2.2 病毒滴度的测定 |
| 3.2.3 蛋白表达条件的摸索 |
| 3.2.4 重组蛋白的纯化 |
| 3.2.5 重组蛋白的鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组杆状病毒的获得 |
| 3.3.2 不同MOI对活细胞率的影响 |
| 3.3.3 信号肽对KGF-1蛋白表达的影响 |
| 3.3.4 细胞数对KGF-1蛋白的表达的影响 |
| 3.3.5 蛋白纯化及稳定性 |
| 3.3.6 HPLC鉴定 |
| 3.3.7 MALDI-TOF鉴定 |
| 小结 |
| 第四章 ：rhKGF-1的活性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 试剂设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 HaCat细胞培养 |
| 4.3.2 BaF3细胞培养及检测方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 细胞培养 |
| 4.4.2 HaCat细胞培养及检测结果 |
| 4.4.3 BaF3检测结果 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 ：rhKGF-1与急性肝损伤 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试剂及溶液配制 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 急性肝损伤模型的建立 |
| 5.2.2 rhKGF-1对急性肝损伤的保护 |
| 5.2.3 血清中ALT和AST分析 |
| 5.2.4 肝组织中MDA和SOD的测定 |
| 5.2.5 HE染色 |
| 5.2.6 rhKGF-1对人肝细胞的作用 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 血清中ALT和AST的分析 |
| 5.3.2 组织中MDA和SOD的分析 |
| 5.3.3 小鼠肝组织切片HE染色 |
| 5.3.4 CCl_4诱导肝细胞损伤后上清的变化 |
| 5.3.5 KGF-1对肝细胞增殖的影响 |
| 5.3.6 KGF-1蛋白对CCl_4诱导的人正常肝细胞HL7702损伤的作用 |
| 5.4 小结 |
| 第七章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间发表学术论文情况 |
（6）腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因抑制PVR的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、PVR动物模型的建立 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 对象 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 眼科检查结果 |
| 1.2.2 眼科B超结果 |
| 1.2.3 PVR分级 |
| 1.2.4 组织病理学检查 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 PVR的基本病理过程和分期 |
| 1.3.2 常见PVR动物模型的建立方法 |
| 1.3.3 玻璃体腔注射人PRP联合巩膜外冷冻建立兔PVR模型 |
| 1.4 小结 |
| 二、p21~(WAF1/CIP1)在PVR发病中作用机制的研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 对象 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 WB方法检测视网膜p21~(WAF1/CIP1)、CDK2、cyclin E蛋白表达 |
| 2.2.2 RT-PCR法检测视网膜p21~(WAF1/CIP1)、CDK_2、cyclin E mRNA的表达 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 细胞因子在PVR发病中的作用 |
| 2.3.2 细胞周期及其调控机制 |
| 2.3.3 p21~(WAF1/CIP1)的生物学功能 |
| 2.3.4 p21~(WAF1/CIP1)在PVR发病机制中的作用 |
| 2.4 小结 |
| 三、腺病毒介导外源性p21~(WAF1/CIP1)基因抑制体外培养hRPE细胞增殖及迁移 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 对象 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 p21~(WAF1/CIP1)基因转染人视网膜色素上皮细胞形态及数目的影响 |
| 3.2.2 MTT法检测细胞增殖 |
| 3.2.3 Transwell检测细胞迁移 |
| 3.2.4 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 3.2.5 WB法检测p21~(WAF1/CIP1)、CDK_2、cyclin E蛋白的表达 |
| 3.2.6 RT-PCR方法检测p21~(WAF1/CIP1)、CDK_2、cyclin E mRNA的表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 RPE细胞在PVR发病中的作用研究 |
| 3.3.2 p21~(WAF1/CIP1)基因对hRPE细胞增殖及迁移能力的影响 |
| 3.3.3 腺病毒转染p21~(WAF1/CIP1)基因对hRPE细胞周期调控的机制 |
| 3.4 小结 |
| 四、腺病毒介导p21~(WAF1/CIP1)基因抑制兔PVR的实验研究 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 对象 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 临床观察结果及PVR分级 |
| 4.2.2 标本大体观察及病理结果 |
| 4.2.3 WB及RT-PCR检测视网膜p21~(WAF1/CIP1)、CDK_2、cyclin E表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 腺病毒介导堆因转染技术在眼部疾病中的应用 |
| 4.3.2 增生性玻璃体视网膜病变的治疗现状 |
| 4.3.3 腺病毒介导p21~(WAF1/CIP1)基因对PVR的抑制作用 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（7）白内障患者诱导性多能干细胞（iPS）的建立及其定向分化的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 原代人晶体上皮细胞的体外培养 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 白内障患者诱导性多能干细胞的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 白内障患者诱导性多能干细胞的鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 白内障患者诱导性多能干细胞向晶体前体细胞的分化诱导 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 诱导多能干细胞(iPS)在眼科的研究与应用进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表情况 |
| 在读期间获奖情况 |
| 致谢 |
（8）奶牛体细胞的纯化与人COL1α1 cDNA转染及核移植胚胎发育研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 生物反应器研究进展简介 |
| 1 基因工程菌作为反应器研究进展 |
| 2 酵母生物反应器生产重组蛋白 |
| 3 昆虫细胞作为生物反应器生产重组蛋白 |
| 4 转基因禽类生物反应器 |
| 5 哺乳动物乳腺生物反应器 |
| 5.1 哺乳动物乳腺生物反应器原理及应用 |
| 5.2 转基因乳腺生物反应器的载体与方法 |
| 综述二 胶原蛋白研究概况 |
| 1 胶原蛋白的分布 |
| 2 胶原蛋白的分类 |
| 3 胶原的结构 |
| 4 胶原蛋白的生物合成 |
| 5 Ⅰ型胶原的功能与应用 |
| 6 胶原蛋白的制备方法 |
| 7 乳腺表达重组胶原蛋白的研究进展 |
| 第二部分 实验部分 |
| 实验一 人Ⅰ型A1胶原CDNA基因乳腺特异表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 RNA的分离提取 |
| 1.3 胶原α1链cDNA的反转录合成与扩增 |
| 1.4 人Ⅰ型α1胶原cDNA基因克隆载体的构建与基因测序 |
| 1.5 pET-44a(+)-COL1α1 cDNA重组质粒的构建 |
| 1.6 乳腺特异性表达载体引入胶原蛋白cDNA和6×His标签 |
| 1.7 乳腺特异性表达载体引入加强型绿色荧光蛋白(EGFP)和新霉素抗性(Neo~r)双标记基因 |
| 1.8 质粒载体pBC1-COL1α1-EGFP-Neo~r的DNA鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 人Ⅰ型α1胶原cDNA基因的测序结果 |
| 2.2 载体pBC1-COL1α1-EGFP-Neo~r的DNA鉴定 |
| 3 讨论 |
| 实验二 牛成纤维细胞系的建立及转基因条件的优化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 牛成纤维细胞系的建立 |
| 1.3 荷斯坦奶牛耳成纤维细胞对G418耐受实验 |
| 1.4 人Ⅰ型胶原基因真核表达质粒的细胞转染 |
| 1.5 早期转染细胞的形态观察和表达效率 |
| 1.6 阳性克隆的筛选纯化与放大培养 |
| 1.7 阳性克隆细胞的生长曲线 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 成纤维细胞的生长 |
| 2.2 荷斯坦奶牛耳成纤维细胞对G418耐受曲线 |
| 2.3 质粒的用量与转染效果 |
| 2.4 阳性克隆的筛选纯化与放大培养 |
| 2.5 转基因细胞的生长曲线 |
| 3 讨论 |
| 3.1 成纤维细胞系的建立 |
| 3.2 双标记的筛选 |
| 3.3 DNA用量对脂质体转染效果的影响 |
| 3.4 转基因细胞的纯化 |
| 3.5 转基因细胞的生长曲线 |
| 3.6 转基因细胞筛选的注意事项 |
| 实验三 牛卵丘细胞系的建立及转染质粒DNA的效果分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 牛卵丘细胞系的建立与观察 |
| 1.3 牛卵丘细胞的生长曲线 |
| 1.4 牛卵丘细胞转染质粒载体pMSCV-EGFP-Neo~r和pBC1-COL1α1-EGFP-Neo~r |
| 1.5 阳性细胞形态观察和表达效率的分析 |
| 1.6 牛卵丘细胞对G418的耐受实验 |
| 1.7 阳性克隆的筛选与扩大 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞的形态观察与生长曲线 |
| 2.2 转染细胞的早期观察与效率分析 |
| 2.4 阳性克隆的筛选与扩大 |
| 3 讨论 |
| 3.1 卵丘细胞的生长 |
| 3.2 阳离子脂质体介导基因转移的机制 |
| 3.3 两种质粒的转染效果 |
| 实验四 牛输卵管上皮细胞的培养与转基因研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 奶牛输卵管上皮细胞系的建立 |
| 1.3 输卵管上皮细胞的生长曲线 |
| 1.4 脂质体介导的输卵管上皮细胞的转染 |
| 1.5 电穿孔法介导的输卵上皮细胞的转染 |
| 1.6 转基因细胞的筛选和扩大 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞的生长观察 |
| 2.2 输卵管上皮细胞对低渗缓冲液的耐受 |
| 2.3 输卵管上皮细胞的电穿孔效率研究 |
| 2.4 转基因细胞的筛选和扩大 |
| 3 讨论 |
| 实验五奶牛体外培养细胞的凋亡趋势 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 体外培养细胞系的建立 |
| 1.3 输卵管上皮细胞不同培养时段细胞的早期凋亡 |
| 1.4 体外培养不同类型体细胞的早期凋亡趋势 |
| 1.5 膜联蛋白V-FITC标记法定量检测细胞早期调亡的解读 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 泌乳期牛乳腺上皮细胞系的纯化 |
| 2.2 输卵管上皮细胞不同生长阶段早期凋亡 |
| 2.3 体外培养不同类型体细胞的早期凋亡趋势 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞凋亡引起的细胞变化 |
| 3.2 细胞凋亡的早期检测 |
| 实验六体细胞转基因核移植胚胎发育的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 卵母细胞的体外成熟培养(IVM) |
| 1.3 转基因阳性供体细胞和非转基因供体细胞的准备 |
| 1.4 核移植(NT) |
| 1.5 电融合 |
| 1.6 重构胚的激活与体外培养(IVC) |
| 1.7 实验设计 |
| 1.8 统计分析 |
| 1.9 阳性核移植胚胎的PCR扩增鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 转基因成纤维细胞不同克隆系之间核移植胚胎的发育 |
| 2.2 供体细胞转基因对核移植胚胎发育的影响 |
| 2.3 不同类型细胞转基因后核移植胚胎发育的比较 |
| 3 讨论 |
| 总结与展望 |
| 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（9）狂犬病病毒保护性抗原基因重组伪狂犬病毒/杆状病毒活疫苗的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 狂犬病病毒分子生物学研究进展 |
| 第2章 伪狂犬病病毒的细胞生物学和分子特征研究进展 |
| 第3章 杆状病毒在昆虫和哺乳动物细胞中作为高效载体的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 表达狂犬病病毒ERA株和CTN株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-(TK~-/gE~-/2G~+)的构建、鉴定及免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 重组病毒的构建 |
| 3 TK~-/gE~-/2G~+重组病毒的鉴定 |
| 4 动物实验 |
| 5 结果 |
| 6 讨论 |
| 7 小结 |
| 第2章 表达狂犬病病毒SRV9株的核蛋白和糖蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-(Bartha-SN-SG)的构建、鉴定及免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 重组病毒的构建 |
| 3 重组病毒的鉴定 |
| 4 动物实验 |
| 5 结果 |
| 6 讨论 |
| 7 小结 |
| 第3章 表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白的重组杆状病毒BV-VSV/G-G的构建、鉴定及免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 重组杆状病毒的构建 |
| 3 动物实验 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（10）超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的实验研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：超声微泡造影剂介导EGFP 质粒转染大鼠视网膜的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 实验性大鼠脉络膜新生血管模型研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 微泡介导转染与其他转染方法的比较 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 不同方式注射微泡介导转染的比较 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 文献综述：糖尿病性视网膜病变基因治疗的研究进展 |
| 致谢 |
| 研究生在读期间发表论文 |
四、杆状病毒介导LacZ基因转染体外培养的人虹膜色素上皮细胞(英文)（论文参考文献）
- [1]猪γ干扰素与猪α干扰素扩大培养工艺优化[D]. 冯剑. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]Bcl-xL基因修饰人脐带血干细胞移植修复兔关节软骨损伤的实验研究[D]. 潘政军. 安徽医科大学, 2019(07)
- [3]鸡输卵管组织特异性启动子克隆及功能验证[D]. 赵颖慧. 中国农业科学院, 2014(11)
- [4]鸭甲肝病毒1型一个保守的中和性线性B细胞表位的确定[D]. 周国梅. 山东农业大学, 2012(07)
- [5]角质细胞生长因子-1（KGF-1）在昆虫细胞中的表达及其活性研究[D]. 薛萍. 吉林农业大学, 2012(05)
- [6]腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因抑制PVR的研究[D]. 袁志刚. 天津医科大学, 2012(01)
- [7]白内障患者诱导性多能干细胞（iPS）的建立及其定向分化的研究[D]. 邱晓頔. 复旦大学, 2012(04)
- [8]奶牛体细胞的纯化与人COL1α1 cDNA转染及核移植胚胎发育研究[D]. 吕自力. 石河子大学, 2011(05)
- [9]狂犬病病毒保护性抗原基因重组伪狂犬病毒/杆状病毒活疫苗的实验研究[D]. 黄海楠. 吉林大学, 2011(09)
- [10]超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的实验研究[D]. 许燕. 重庆医科大学, 2007(02)