一、Rel/NF-κB/IκB/IKK信号转导途径与动脉粥样硬化（论文文献综述）
李藤藤[1]（2021）在《ICA通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应》文中研究指明随着生活水平提高和生活方式的改变,动脉粥样硬化（AS）等心血管疾病病发率呈现逐年上升的趋势。AS是一种涉及平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞等多种细胞的慢性炎症性疾病,并伴随着一系列的并发症,给人们的生活带来诸多的困扰。淫羊藿是我国一种传统的药用植物,主要化学成分有黄酮、木脂素、苯酚苷、生物碱、多糖、挥发油、蒽醌、鞣质、甾醇、倍半萜等。淫羊藿苷（ICA）是淫羊藿的主要化学成分,是一种黄酮类的化合物,具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老、抗骨质疏松、抗心肌缺血缺氧、促进免疫调节及促进生殖内分泌功能等多种药理作用。ICA具有抗AS的作用,目前多集中于ICA对平滑肌细胞增殖迁移、内皮细胞损伤等的研究,对巨噬细胞炎症反应的相关研究比较少。微小RNA（microRNA,miRNA）是一种短链非编码RNA,miRNA在细胞的增殖、分化,生物体的生长、发育及疾病治疗中发挥着越来越重要的作用。研究表明,miRNAs能够成为心血管疾病的治疗靶点、诊断标志。因此为我们寻找治疗、诊断AS提供了新思路和方法。本课题组前期实验研究已证实ICA具有抗AS的作用,并且构建了 ApoE-/-小鼠胸主动脉miRNA表达谱,但是有关ICA发挥抗AS的具体分子机制尚需进一步探索和研究。本研究从miRNA芯片入手,利用生物信息学分析构建了miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路,并以该信号通路为切入点研究ICA对ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应及分子机制。本研究分为3部分:（1）ICA 抗 AS miRNAs 芯片生物信息学分析及 miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路构建首先比较ApoE-/-小鼠胸主动脉MOD组/CON组miRNA芯片结果,将差异基因的条件设定为p<0.05且|log2 fold change|>1.32,筛选出差异表达的miRNAs共16个。为了寻找RAW264.7中ICA发挥抗AS的关键miRNAs,随机挑选6个miRNAs,利用qPCR技术进行miRNAs表达的验证并确定miR-672-5p作为研究对象。通过TargetScan和DAVID数据库对其靶基因进行预测、GO分析及KEGG分析,我们发现miR-672-5p与细胞增殖、凋亡,蛋白质的转录与翻译等生物学过程密切相关,在miR-672-5p富集的信号通路中PI3K-AKT通路p值较小、富集到其中的靶基因较多,同时AKT3 mRNA的3’ UTR处与miR-672-5p存在结合位点且靶向性较好,因此我们构建出miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路。（2）ICA对ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应的作用及机制研究以ox-LDL诱导RAW264.7构建巨噬细胞源性泡沫细胞,同时加入ICA进行干预,通过 CCK-8、油红 O 染色、ELISA、qPCR 及 Western Blot 探讨 ICA 对 ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应的作用,结果发现,ox-LDL可以降低RAW264.7细胞活力,诱导RAW264.7的泡沫化,增加培养上清IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。ICA可以逆转上述反应的变化。说明ICA可以抑制ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应。进一步通过qPCR和Western Blot检测miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路相关基因及蛋白表达,结果表明,ox-LDL可以降低RAW264.7中miR-672-5p的表达,提高AKT3 mRNA及蛋白的表达,并且上调IKK、IκBα及p65的磷酸化水平,而ICA可以逆转上述基因和蛋白表达的改变。说明ICA可能通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路,从而抑制ox-LDL诱导RAW264.7的炎症反应。（3）miR-672-5p在ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应中的作用构建过表达/沉默miR-672-5p的RAW264.7,利用油红O染色、ELISA、qPCR及Western Blot技术探讨miR-672-5p在ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应的作用。结果发现,ox-LDL可以诱导RAW264.7的泡沫化,增加RAW264.7培养上清IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的含量,降低 RAW264.7 miR-672-5p 的表达,提高 AKT3 mRNA及蛋白的表达,并且上调IKK、IκBα和p65的磷酸化水平。过表达miR-672-5p可以逆转ox-LDL的作用,而沉默miR-672-5p则增强ox-LDL的作用。说明miR-672-5p通过调控AKT3,介导NF-κB信号通路,从而抑制ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应。综上所述,本实验证明ICA可能通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路,抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应,进而治疗AS。miR-672-5p是ICA治疗AS的分子靶点。
王栩越[2]（2021）在《靶向干预NF-κB通路对压力超负荷性心肌重塑的作用研究》文中指出目的:靶向干预NF-κB-p65对压力超负荷所致心功能不全大鼠心肌重塑的作用。方法:（1）细胞实验:选用血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）诱导H9C2细胞损伤模型。MTT实验检测细胞活性,筛选最优给药浓度。细胞六孔板中常规培养,生长至六孔板面积的80%弃去原有培养基将细胞分为（1）Control组:常规高糖培养基培养;（2）AngⅡ组:AngⅡ（1μmol/L）作用24h;（3）AngⅡ+PDTC组:PDTC（100μmol/L）预处理1h后PBS清洗3次,AngⅡ（1μmol/L）作用24h;（4）PDTC组:PDTC（100μmol/L）处理1h后PBS清洗3次,常规培养24h。收集细胞,分别选用流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测各组凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、心肌细胞损伤相关蛋白心房钠尿肽（ANP）和细胞核内P65的表达。（2）动物实验,选取6周龄血压相对稳定的SD大鼠以每组10只随机分为4组（1）Sham组:大鼠开腹后直接关闭腹腔;（2）AAC组:通过腹主动脉缩窄术（abdominal aortic coarctation,AAC）复制大鼠压力超负荷性心肌损伤模型;（3）AAC+e GFP组:腹主动脉缩窄术后3天尾静脉注射空载9型腺相关病毒;（4）AAC+e GFP-p65组:腹主动脉缩窄术后3天尾静脉注射沉默p65的腺相关病毒。8周后,测定体重、血压,处死动物,测量左心指数,留取心脏和血液标本;q RT-PCR检测感染病毒后各组m RNA水平p65的表达;免疫组织化学检测心肌组织总P65的表达;Western blot检测病毒荧光标记蛋白GFP、细胞核内P65、Cleaved caspase-3表达水平;Masson染色、HE染色、TUNEL染色检测心肌病理改变;ELISA法检测大鼠血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的含量。结果:（1）细胞实验:Western blot结果显示:与Control组比,AngⅡ组细胞核内P65表达增高、ANP表达增高、Bcl-2表达降低、Bax表达增高（P<0.05）;与AngⅡ组比,AngⅡ+PDTC组细胞核内P65表达降低、ANP表达减低,Bcl-2表达增高,Bax表达降低（P<0.05）;与Control组比,PDTC组细胞核内P65表达降低（P<0.05）,其它蛋白水平均无明显变化（P>0.05）。流式细胞术检测结果显示:与Control组比,AngⅡ组细胞凋亡数量百分比增高（P<0.05）;与AngⅡ组比,AngⅡ+PDTC组细胞凋亡数量百分比减低（P<0.05）;与Control组比,PDTC组细胞凋亡数量百分比无明显变化（P>0.05）。（2）动物实验:q RT-PCR检测结果显示:与Sham组比,AAC+e GFP-p65组大鼠p65减低（P<0.05）,而AAC组和AAC+e GFP组大鼠p65无明显变化（P>0.05）。血流动力学和心脏质量检测结果显示:与Sham组比,AAC组和AAC+e GFP组大鼠收缩压（SBP）、舒张压（DBP）上升（P<0.05）,左室压力最大上升速率（+dp/dtmax）、左室压力最大下降速率（-dp/dtmax）降低（P<0.05）;与AAC组比,AAC+e GFP-p65组SBP、DBP无差异（P>0.05）,左室+dp/dtmax、-dp/dtmax增高（P<0.05）。病理组织学检测显示:与Sham组比,AAC组和AAC+e GFP组大鼠HE染色显示细胞横截面积变大、TUNEL染色显示心肌凋亡百分比增高（P<0.05）、Masson染色检测心肌旁胶原纤维增多（P<0.05）、免疫组织化学检测P65含量无明显变化（P>0.05）;与AAC组比,AAC+e GFP组大鼠各项病理组织学检测均无差异（P>0.05）,而AAC+e GFP-p65组大鼠HE染色显示细胞横截面积减小、TUNEL染色显示心肌凋亡百分比减低（P<0.05）、Masson染色检测心肌旁胶原纤维减少（P<0.05）。Western blot结果显示:与Sham组比,AAC+e GFP组和AAC+e GFP-p65组GFP表达量明显增高（P<0.05）。与Sham组比,AAC组和AAC+e GFP组大鼠细胞核内P65表达增高、Cleaved-caspase-3表达增高（P<0.05）;与AAC组比,AAC+e GFP组大鼠以上两种蛋白表达均无差异（P>0.05）,而AAC+e GFP-p65组大鼠细胞核内P65表达降低、Cleaved-caspase-3表达降低（P<0.05）。ELISA检测结果显示:与Sham组比,AAC组和AAC+e GFP组大鼠血清中TNF-α、IL-6含量升高（P<0.05）;与AAC组比,AAC+e GFP组大鼠血清中TNF-α、IL-6含量均无差异（P>0.05）,而AAC+e GFP-p65组大鼠血清中TNF-α含量降低（P<0.05）,但IL-6含量无差异（P>0.05）。结论:靶向干预NF-κB-p65减轻压力超负荷所致心功能不全大鼠心肌重塑。
李令兴[3]（2020）在《巨噬细胞来源CXCL12在动脉粥样硬化中的作用及相关分子机制的研究》文中提出研究背景心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）在世界范围内都是威胁人类健康并导致死亡的主要原因。《中国心血管病报告2018》概要显示,无论是城镇居民还是在农村居民,心血管病死亡率都占总死亡原因的首位,远远高于肿瘤及其他疾病。动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）已被确定为CVD的主要潜在病因,动脉粥样硬化病变的发生发展可能需要氧化-低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）的参与。动脉粥样硬化及其血栓形成并发症的其他风险因素包括高血压、吸烟和糖尿病等。诱导动脉粥样硬化发生发展的因素很多,巨噬细胞的泡沫化是尤为关键的因素。巨噬细胞在血管壁内聚集是动脉粥样硬化的标志。在动脉粥样硬化病变中,巨噬细胞对各种环境刺激做出反应,如修饰的脂质、细胞因子和衰老的红细胞,可改变其功能表型。了解巨噬细胞的功能及其对动脉粥样硬化斑块形成和生长的作用,将有助于延缓或阻止疾病的发生发展,并为治疗动脉粥样硬化相关疾病及改变其病理生理提供新的理论支持和治疗策略。此外,有研究表明,巨噬细胞分泌的趋化因子对动脉粥样硬化的发生发展也发挥了重要的作用。趋化因子CXCL12,也称为基质细胞衍生因子1（Stromal cell derived factorSDF-1）、趋化因子样功能趋化因子和巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）。CXCL12是广泛表达且高度保守的蛋白,通过与其相应的趋化因子受体CXCR4和ACKR3结合,在细胞稳态、募集和阻滞中发挥重要作用。此外,大量研究证实CXCL12对于造血祖细胞在骨髓中归巢及其向外周动员中起到关键作用。CXCL12/CXCR4除了对祖细胞有这些作用外,还可能通过影响各种动脉粥样硬化相关细胞来影响动脉粥样硬化相关疾病的发生和发展。但巨噬细胞分泌的CXCL12在动脉粥样硬化中起到的作用并不清楚,在本研究中,我们通过一系列的实验设计来探讨巨噬细胞CXCL12在动脉粥样硬化中发挥的作用及其相关机制,解决这一科学问题将为治疗动脉粥样硬化性疾病提供新的理论依据并且有可能创造新的治疗策略。研究目的1.明确巨噬细胞分泌的CXCL12在动脉粥样硬化发生发展中的作用。2.明确巨噬细胞分泌CXCL12是否通过影响血管平滑肌细胞（VSMCs）发挥作用。研究方法1.建立细胞模型利用豆蔻酰佛波醇乙酯（PMA）诱导单核巨噬细胞（THP-1）48小时,使其分化发育成巨噬细胞。然后,使用ox-LDL诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞作为动脉粥样硬化的细胞模型。2.细胞免疫荧光检测将VSMCs接种于12孔板的盖玻片上,培养过夜。多聚甲醛固定后,使用Triton X-100透化细胞,然后使用BSA封闭。将细胞与抗α-SMA的一抗在4℃下孵育过夜,然后与Alexa Fluor 488标记的二抗在室温下孵育1小时。DAPI染色显示细胞核。最后,使用激光扫描共聚焦显微镜检测。3.HE、免疫组织荧光（IF）或免疫组织化学（IHC）检测取大鼠或小鼠对照组和模型组肺动脉或胸主动脉做成蜡块,切片后进行相应的染色（HE、IF或IHC）。4.Transwell 共培养将VSMCs接种到Transwell板的下室,将THP-1巨噬细胞接种到上室。然后用ox-LDL处理THP-1巨噬细胞。接下来,将VSMCs和THP-1巨噬细胞共培养24或48小时,用于后续实验。5.细胞增殖检测VSMCs接种于Transwell板的下室,将THP-1巨噬细胞接种于上室。处理结束后,向VSMCs中加入MTT再培养2小时,最后加入DMSO,用酶标仪测定490 nm处的吸光度。6.酶联免疫吸附测定（ELISA）检测孵育48小时后收集细胞培养上清（Transwell共培养体系上室和下室）,用CXCL12的ELISA试剂盒进行检测。7.Western blot 检测从THP-1巨噬细胞或VSMCs中提取的总蛋白样品,用10%SDS/PAGE分离。然后,将蛋白条带转移至PVDF膜上,随后用5%脱脂乳封闭。将膜与CXCL12或GAPDH的一抗在4℃孵育过夜。次日,使用1×TBST孵育3次,用HRP标记的羊抗小鼠或抗兔IgG在室温下孵育1小时。用ECL底物检测免疫染色蛋白条带。8.油红O染色将细胞在载玻片上培养过夜,随后用ox-LDL处理,用4%多聚甲醛固定后,用0.3%油红O对细胞染色20分钟,用显微镜观察并采集图像。9.RNA提取及qPCR检测TRIZOL提取细胞总RNA。使用逆转录酶试剂盒将总RNA样品逆转录为cDNA。用SYBR Green qPCR试剂盒进行实时定量PCR测定GAPDH和CXCL12表达的相对水平。10.siRNA细胞转染及shRNA细胞转染将细胞铺板于六孔板中,培养至50-80%。然后根据使用说明书,Lipofectamine 2000转染siRNA,用于后续实验。进行基因shRNA设计,构建载体（由安徽通用生物科技有限公司提供）,高纯质粒提取,转染细胞,筛选慢病毒稳转细胞株。11.流式细胞术检测细胞周期弃掉细胞培养上清,用冷PBS冲洗细胞后,轻吹细胞形成细胞悬液,取100ul的细胞悬液于1.5 mL Eppendorf管中,加入PI（最终浓度为50 μg/mL）染料和RNase A（最终浓度为20 μg/mL）,避光冰上孵育30min后,用200目滤器过滤细胞,应用流式细胞仪进行细胞周期检测。12.构建动脉粥样硬化动物模型大鼠动脉粥样硬化模型构建雄性Sprague-Dawley大鼠（12周龄）10只,将SD大鼠随机分为对照组（n=5只大鼠）和模型组（n=5只大鼠）。根据参考文献所述,通过向大鼠喂食高脂饲料加维生素D2三周后建立动脉粥样硬化动物模型。小鼠动脉粥样硬化模型构建雌性ApoE-/-小鼠（8周龄）14只,将小鼠随机分为对照组（n=7只小鼠）和模型组（n=7只小鼠）。根据参考文献所述,通过向小鼠喂食高脂饲料24周建立动脉粥样硬化模型。13.统计学分析使用GraphPad Prism 7.0软件分析所有数据,两组之间的数据比较采用独立样本的t检,P值<0.05具有统计学差异。实验结果1.成功构建动脉粥样硬化的细胞模型并进行相应验证ox-LDL诱导巨噬细胞24小时后,油红O染色结果显示,脂质堆积,48小时后,油红O染色结果显示,脂质堆积显着增加,巨噬细胞泡沫化加剧。在ox-LDL处理的巨噬细胞中,CXCL12的表达显着增加,培养上清中巨噬细胞分泌的CXCL12亦显着增加。2.ox-LDL的刺激同样可以促进VSMCs的泡沫化对培养的VSMCs进行α-SMA免疫荧光检测,结果显示所有细胞均为α-SMA阳性。使用油红O染色评价泡沫细胞形成的水平,结果显示ox-LDL处理24后可以诱导脂滴积聚,并在48小时后脂滴积聚显着加剧。通过ELISA和qPCR进一步分别检测了 VSMCs培养上清和VSMCs的CXCL12分泌水平和转录水平,结果发现ox-LDL处理后的VSMCs培养上清CXCL12浓度显着增加,VSMCs的CXCL12转录水平亦显着增加。3.ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞促进VSMCs增殖及其泡沫细胞的形成与不用ox-LDL预处理的THP-1巨噬细胞共培养的VSMCs的增殖没有显着提高,相比,与用ox-LDL预处理的THP-1巨噬细胞共培养的VSMCs的增殖显着提高。与上室不放THP-1巨噬细胞,只放ox-LDL的对照组相比,VSMCs的增殖并没有显着提高。此外,结果还发现在经过ox-LDL预处理的THP-1巨噬细胞共培养的VSMCs中,泡沫细胞的形成显着增加。通过ELISA和Western blot检测发现ox-LDL处理后的下室培养基中CXCL12浓度显着升高,上室THP-1巨噬细胞CXCL12的表达也显着提高。4.ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞分泌的CXCL12促进VSMCs增殖和泡沫细胞形成在THP-1巨噬细胞中,CXCL12表达能力被siRNA抑制以后,结果发现ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞分泌CXCL12的能力显着降低,其促进VSMCs增殖的能力也显着下降。这种条件的基础上,如果加入外源性的CXCL12则能部分逆转siRNA抑制THP-1巨噬细胞带来的影响,VSMCs的细胞增殖能力又得到显着提高。油红O染色检测VSMCs泡沫细胞的形成,与其增殖结果相一致,此外,利用ELISA和Western blot检测下室培养基CXCL12的浓度改变和THP-1巨噬细胞CXCL12表达的改变,其变化趋势与VSMCs增殖是一致的。本课题设计CXCL12的shRNA克隆到pLKO.1载体上,并通过逆转录病毒载体系统,建立稳定干扰CXCL12的THP-1细胞株。通过qPCR和Western blot检测验证构建的细胞系稳定低表达CXCL12,结果证实稳定干扰CXCL12的THP-1细胞系构建成功。在这种体系下,结果发现,VSMCs细胞增殖趋势与siRNA干扰时一致,且能够促进VSMCs细胞进入细胞周期的S期。5.AS大鼠模型中发病大鼠VSMCs增殖且血清中CXCL12的分泌水平显着升高HE染色结果显示,正常对照组未发现明显的动脉粥样硬化病变,但模型组大鼠肺动脉区域的病变明显扩大;免疫组化染色（IHC）结果显示,α-SMA和IBA-1在诱导成功的动脉粥样硬化大鼠模型中都显着增加。CXCL12在动脉粥样硬化大鼠模型血清中的浓度亦显着增加。6.AS小鼠模型中发病小鼠巨噬细胞分泌的CXCL12显着升高且VSMCs增殖显着增加HE染色结果显示,正常对照组未发现明显的动脉粥样硬化病变,但模型组小鼠胸主动脉区域有显着的动脉粥样硬化斑块,在动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞分泌的CXCL12显着升高。同时,模型组VSMCs的增殖与对照组相比显着提高。通过caspase3检测了斑块中巨噬细胞凋亡情况,结果显示斑块中巨噬细胞凋亡亦显着增加。实验结论1.ox-LDL处理THP-1巨噬细胞和VSMCs可以显着提高CXCL12的分泌水平,并能够显着促进其泡沫化。2.ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞可以促进VSMCs的增殖。3.ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞促进VSMCs的增殖是通过分泌的CXCL12来完成的。4.体内模型中,发现巨噬细胞分泌CXCL12显着提高,VSMCs的增殖亦显着增加。研究背景许多关键信号通路与动脉粥样硬化形成高度相关。这些途径包括:胰岛素受体（和其他受体酪氨酸激酶）;Ras和MAPK活化;导致NF-κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）活化的TNF-α和相关家族成员;活性氧（ROS）对信号的影响;通过修饰的脂蛋白激活内皮和其他细胞;嘌呤能信号;控制白细胞粘附内皮、迁移和进一步激活;泡沫细胞形成;以及与增殖、胞吐和凋亡相关的巨噬细胞和血管平滑肌细胞信号。它们已成为现代动脉粥样硬化研究的重点,无疑将为未来创新干预和预防现代世界头号死因提供丰富的资源。随着对动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞与血管平滑肌细胞相互作用以及巨噬细胞分泌谱如何影响VSMCs表型的新认识,巨噬细胞来源的泡沫细胞和VSMCs之间的通讯形式也变得越来越清晰。然而,ox-LDL通过激活巨噬细胞什么样的信号通路提高巨噬细胞分泌CXCL12以及CXCL12又是通过怎么样信号通路来促进VSMCs的增殖尚未完明确。因此,探讨上述信号在这个过程中起着怎样的作用有助于更进一步的明确巨噬细胞分泌CXCL12促进动脉粥样硬化的分子机制。在人类动脉粥样硬化病变中初步鉴定出活化的NF-κB后,该转录因子家族参与动脉粥样硬化形成得到了越来越多的关注。现在已经清楚,激活NF-κB的信号通路和NF-κB的作用构成了动脉粥样硬化过程所有阶段的主要参与者。长期以来,人们一直认为NF-κB是一种促动脉粥样硬化因子,最近的研究表明,NF-κB的实际作用可能是更加复杂的。除了激活许多与动脉粥样硬化相关的促炎基因外,NF-κB还调节细胞过程,如细胞存活和增殖。此外,在炎症消退和抗炎基因转录中的重要作用表明,它在动脉粥样硬化过程的不同细胞类型或不同阶段的激活可能有不同或相反的结果。同时,NF-κB信号通路在巨噬细胞向泡沫细胞转化中发挥重要作用。但是否参与巨噬细胞分泌CXCL12不清楚,需要进一步的探讨。细胞内丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号级联在心血管疾病的发病机制中起重要作用。大量的基础科学研究已经明确MAPK通路组织和激活的许多细节,但单个信号蛋白在各种心血管疾病发病机制中的作用仍在阐明中。在本研究中,我们将研究ERK（细胞外信号调节激酶）、JNK（c-Jun氨基末端激酶）和p38信号通路在ox-LDL诱导的动脉粥样硬化模型中巨噬细胞分泌CXCL12促进VSMCs增殖时是否会激活VSMCs的MAPK信号通路发挥作用。该研究有利于探明药物治疗动脉粥样硬化的新靶点。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路是各种受体-酪氨酸激酶诱导的关键信号通路之一。越来越多的证据表明,该通路是细胞生长、代谢、存活、增殖和分化中重要的促进因子,与细胞自噬的调控也密切相关。关于该通路已有大量相关研究,但在动脉粥样硬化中的确切作用仍不清楚。有研究发现,选择性抑制AKT/mTOR信号通路可以通过促进巨噬细胞自噬减少,稳定易损的动脉粥样硬化斑块。亦有研究显示PI3K/AKT信号通路是介导VSMC增殖的重要信号转导通路。因此,有必要深入探讨CXCL12是否通过该信号通路发挥作用。综上,对这些关键科学问题的解决,将为治疗动脉粥样硬化提供新的理论依据和新的治疗靶点。研究目的1.明确ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞分泌CXCL12是否通过NF-κB信号通路完成。2.明确ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞分泌的CXCL12是否通过激活VSMCs的MAPK信号通路完成。3.明确ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞分泌的CXCL12是否通过激活VSMCs的PI3K/AKT/mTOR信号通路完成。研究方法1.人单核细胞细胞系THP-1的培养THP-1细胞用1640培养基（含10%FBS,FBS置55℃灭活30min）于T75细胞培养瓶中,置37℃,5%C02孵箱中常规培养,细胞呈悬浮生长。收集THP-1细胞悬液,用1640培养基（含10%灭活的FBS,佛波酯PMA10ng/mL,PMA用于刺激细胞贴壁）重悬,计数铺于24孔板中继续培养,进行下一步实验。2.BMDM诱导实验无菌取C57小鼠后腿,去掉肉留下骨头,用2ml注射器将骨髓吹出,并用反复吹打数次,将骨髓吹散。Tris-NH4CL红细胞裂解液裂解红细胞。重悬细胞并计数。浓度调整为2×106个细胞/ml。10cm培养皿中可加入7-8ml细胞,用BMDM诱导培养基培养,每2-3天换液,去除悬浮细胞,7天可收获成熟BMDM。3.Transwell 共培养将 VSMCs 接种到 Transwell 板（3422,Coming,NY,U.S.A.）的下室,将 THP-1细胞接种到上室。然后用ox-LDL处理THP-1细胞。接下来,将VSMCs和THP-1细胞培养24或48小时。4.细胞总蛋白的提取及Western Blot实验吸弃各孔细胞培养上清,每孔加入适量含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液,充分裂解细胞,用BCA蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白浓度测定。取各孔相应体积的蛋白加入6×蛋白上样缓冲液中,充分混匀,98℃加热5 min,冷却后,可直接将样品用于SDS-PAGE,亦可暂存-20℃或-80℃。根据实验需要取相应体积的蛋白样品及预染蛋白marker上样进行电泳。使用超敏显色液（Thermo scientific,34095）进行ECL法显影。5.SiRNA 转染将细胞铺板于六孔板中,培养至30-50%融合,然后根据生产商的说明,使用 Lipofectamine 2000（Invitrogen,Carlsbad,CA,U.S.A.）转染 siRNA。6.小鼠动脉粥样硬化模型雌性ApoE-/-小鼠（8周龄,购买自北京维通利华,SPF级）,将小鼠随机分配至对照组（n=7只小鼠）和模型组（n=7只小鼠）。按照参考文献所述,通过向小鼠喂食高脂饲料24周建立动脉粥样硬化模型。7.统计学分析使用GraphPad Prism7.0软件分析所有数据,两组之间的数据比较采用独立样本的t检,P<0.05具有统计学差异。实验结果1.ox-LDL通过NF-κB信号通路诱导巨噬细胞表达分泌CXCL12无论是THP-1源巨噬细胞还是BMDM在ox-LDL诱导24小时后IκBα（p-IκBα）的磷酸化显着提高;此外,两种巨噬细胞在ox-LDL刺激24小时后磷酸化的p65（p-p65）的表达变化情况跟IκBα是相一致的;然而,两种巨噬细胞在ox-LDL刺激24小时后磷酸化的p52（p-p52）的表达并没有显着变化。NF-κB信号通路被白藜芦醇阻断后,ELISA和Western blot检测培养上清中或THP-1巨噬细胞在ox-LDL诱导下分泌或表达CXCL12的水平显着下降。2.CXCL12通过激活VSMCs的ERK或JNK信号通路而促进VSMCs异常增殖THP1存在的情况下,ox-LDL可以刺激VSMCs的ERK磷酸化显着提高。在此的基础上增加外源CXCL12则会重新使VSMCs的ERK磷酸化水平显着提高。JNK的趋势与ERK一致,但是p38在各组之间没有显着差异。3.PI3K/AKT/mTOR信号通路不参与Transwell体系中CXCL12刺激VSMCs的异常增殖不同条件下VSMCs的AKT的磷酸化水平并没有显着差异,VSMCs的GSK-3β的磷酸化水平没有显着变化,VSMCs的mTORC1的磷酸化水平亦没有显着变化。4.白藜芦醇显着减轻ApoE-/-小鼠高脂饮食诱导动脉粥样硬化的斑块面积,高脂饮食的ApoE-/-小鼠如果同时给予白藜芦醇饮水,则显着降低其动脉粥样硬化斑块面积。实验结论1.ox-LDL通过激活THP-1或BMDM的NF-κB信号通路的经典途径中p65的磷酸化而促进CXCL12的表达和分泌。2.参与CXCL12刺激VSMCs增殖的可能效应分子是MAPK信号通路下游的ERK或JNK,而不是p38。3.PI3K信号通路中的AKT、Raptor或者GSK-3在CXCL12刺激VSMCs增殖中不发挥作用。
刘依侬[4]（2020）在《Ox-LDL复合物通过NF-κB介导的炎症信号通路对血管内皮细胞损伤机制研究》文中指出目的:通过氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）复合物对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化应激损伤的研究,探讨Ox-LDL复合物对血管内皮细胞的损伤机制,旨在寻找动脉粥样硬化新的治疗靶点。方法:1.收集吉林大学第二医院动脉粥样硬化患者（n=300）和与之年龄匹配的健康人（n=300）的脂蛋白生物标志物水平,包括TG、TC、LDL-C、apo B、HDL-C、apo A、FFA、Lp（a）。2.采用MTT实验检测Ox-LDL及其复合物对HUVECs增殖活力的影响;采用蛋白免疫印迹分析法检测TRAF3IP2、PPARγ、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Phospho-IKKγ及Phospho-NF-κB p65等的表达水平。3.采用细胞划痕实验观察不同刺激物对HUVECs迁移能力的影响。4.应用化学荧光探针法在荧光显微镜下观察细胞内活性氧（ROS）水平的变化。5.应用免疫荧光染色法观察Phospho-NF-κB p65核易位情况。采用RT-PCR及ELISA方法检测TNF-α、IL-1β及ET-1的m RNA及蛋白水平。结果:1.与健康人相比,动脉粥样硬化患者TG、TC、LDL-C、apo B、FFA及Lp（a）水平均升高（P<0.01）,HDL-C及apo A水平均下降（P<0.001）。2.Ox-LDL、Ox-LDL/β2GPI及Ox-LDL/β2GPI/anti-β2GPI三元复合物作用于HUVECs 12 h后,ROS水平升高,细胞迁移能力下降（P<0.05）,诱导形成明显的氧化应激损伤,其中Ox-LDL/β2GPI/anti-β2GPI三元复合物处理组作用最强（P<0.001）。阿托伐他汀能减轻这些损伤（P<0.05）。3.Ox-LDL/β2GPI及Ox-LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物处理后,IL-1β、TNF-α及ET-1蛋白及m RNA水平升高（P<0.05）,阿托伐他汀可抑制该炎症反应（P<0.05）。4.Ox-LDL/β2GPI/anti-β2GPI三元复合物处理组能够上调TRAF3IP2及Phospho-NF-κB p65蛋白表达水平达到最高（P<0.001）。阿托伐他汀可抑制三元复合物诱导的炎症信号（P<0.01）。5.锌可减轻Ox-LDL对HUVECs造成的氧化应激损伤,降低ROS水平,提高细胞迁移能力（P<0.01）,减弱Ox-LDL引起的炎症反应,降低IL-1β、ET-1蛋白及m RNA水平（P<0.05）。6.锌预处理组可抑制Ox-LDL引起的炎症信号,Phospho-NF-κB p65、Cleaved Caspase-3表达水平下降,PPARγ、Bcl-2表达上调（P<0.01）。细胞荧光共聚焦实验显示,Zn能够减弱Ox-LDL引起的Phospho-NF-κB p65入核现象。结论:1.Ox-LDL/β2GPI/anti-β2GPI三元复合物通过TRAF3IP2/IKKγ/NF-κB信号通路,诱导最大程度的血管内皮细胞损伤。2.阿托伐他汀可抑制Ox-LDL/β2GPI/anti-β2GPI三元复合物诱导的HUVECs细胞活力下降、细胞迁移下降、炎症反应、氧化应激损伤等现象。3.锌可以抑制Ox-LDL诱导的HUVECs氧化应激损伤及炎症反应,并且可能通过PPARγ/NF-κB信号通路抑制。
安雅男[5]（2020）在《破骨细胞炎症通路激活和胞葬作用抑制介导糖尿病性骨质疏松的发病机制研究》文中指出随着生活水平日益提高,糖尿病（DM）已经成为最常见的威胁人类和动物健康的内分泌代谢紊乱性疾病,且人和动物患糖尿病的症状相似,均伴随着严重并发症的发生。其中,糖尿病性骨质疏松（DOP）已然成为目前讨论的热点问题。DOP是一种系统性的代谢性骨病,是以骨量减少、骨质微观结构退化为特征的全身性骨骼疾病。目前发现DOP与高血糖症、钙磷代谢紊乱和胰岛素缺乏等因素有关。然而,其发病机制尚不清楚,严重影响其有效防治。DOP与体内炎症存在一定的联系。活性氧（ROS）是氧正常代谢的天然副产物,而高浓度ROS却会扰乱氧化剂与抗氧化剂的平衡,进而导致炎性疾病的发生。NLRP3炎性小体是一种蛋白质复合物,研究发现它不仅与炎性疾病有关,而且与许多代谢性疾病有关,并发现NLRP3炎性小体在机体骨吸收中起到非常重要的作用。核因子κB（NF-κB）是一种转录因子,可调节多个基因的表达并控制各种细胞功能,包括炎症信号传导等。丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）可以控制多种细胞活动,包括基因表达、有丝分裂等。特别是,MAPKs中ERK、p38和JNK在调节炎症和免疫反应中起重要作用。巨噬细胞是关键的免疫细胞,当组织受到损害时,中性粒细胞会迅速蓄积并经历凋亡而通过巨噬细胞清除凋亡细胞的过程称为胞葬作用。未能清除的凋亡细胞会加剧体内的炎症发生,因此胞葬作用在调节机体炎症反应以及促进炎症消退中起到关键作用。破骨细胞是一种巨大的多核细胞,起源于单核巨噬细胞/单核系造血前体细胞,被认为是治疗骨质疏松的靶细胞之一,在骨吸收过程中发挥重要作用。而伴侣动物的自发糖尿病模型较啮齿动物与人类临床糖尿病更相似,并且犬和人类有更相似的染色体和基因结构,更合适作为人类疾病转化医学模型。因此本研究以破骨细胞为靶细胞,以人工诱导糖尿病性骨质疏松大鼠和自发糖尿病性骨质疏松犬为疾病模型,连同人医临床样本为对象,考察高糖是否能够通过破骨细胞ROS的产生、NLRP3炎性小体介导的炎症激活及胞葬作用被抑制共同增强破骨细胞骨吸收,并且在分子以及病理水平上深入探讨了人和动物糖尿病性骨质疏松症的发病机制。首先,我们在国内外首次发现破骨细胞NLRP3炎性小体介导的炎症激活是糖尿病性骨质疏松的发病因素。利用倒置显微镜对分离的破骨细胞诱导情况进行检测;借助荧光酶标仪对ROS产生情况进行探查;通过Western blot技术对炎症相关通路蛋白MAPKs（p-ERK、p-p38、p-JNK）、NF-κB（核NF-κB、p-IκB、IKK）以及NLRP3炎症小体（ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β、NLRP3）的表达水平进行分析;使用ELISA对IL-18、IL-1β的分泌情况进行考查;应用各通路抑制剂处理探究ROS、MAPKs通路、NF-κB通路和NLRP3炎症小体之间的上下游关系。结果表明,经TRAP染色证实,分离到的SD大鼠骨髓巨噬细胞（BMMs）经M-CSF和RANKL诱导后得到的细胞均为成熟的破骨细胞;高糖能够诱导破骨细胞ROS产生且该ROS产生呈NOX2依赖性;高糖能够诱导破骨细胞MAPKs通路蛋白、NF-κB通路蛋白和NLRP3炎症小体蛋白的表达以及IL-18、IL-1β的分泌,且以上最佳诱导时间为36 h,最佳诱导浓度为35 mM;DPI（ROS抑制剂）能够显着抑制MAPKs通路蛋白、NF-κB通路蛋白和NLRP3炎性小体蛋白表达以及IL-18、IL-1β分泌;且PD98059（ERK抑制剂）、SP600125（JNK抑制剂）和SB203580（p38抑制剂）能够显着抑制NF-κB通路蛋白和NLRP3炎症小体蛋白表达以及IL-18、IL-1β分泌,但不能抑制ROS产生;BAY11-7082（NF-κB抑制剂）能够显着抑制NLRP3炎症小体蛋白表达以及IL-18、IL-1β分泌,但不能抑制ROS的产生以及MAPKs通路蛋白表达;而Ac-YVAD-cmk（Caspase-1抑制剂）对其它通路均不存在抑制作用。综上所述,高糖通过诱导破骨细胞ROS产生并激活MAPKs/NF-κB/NLRP3炎症通路诱导破骨细胞炎症发生,且ROS产生发生在MAPKs、NF-κB和NLRP3上游;MAPKs位于NF-κB和NLRP3上游;而NF-κB位于NLRP3炎性小体上游。其次,在国际上,我们率先阐明破骨细胞炎症激活以及胞葬作用抑制共同促进破骨细胞骨吸收能力的增强,是糖尿病性骨质疏松发生的主要因素。应用流式细胞术对破骨细胞胞葬作用的发生情况进行检测;利用ELISA对LXA 4的表达情况进行考查;借助Western blot技术对MertK蛋白的表达水平进行分析,通过Ac-YVAD-cmk处理探究高糖诱导破骨细胞炎症发生与胞葬作用之间的关系;使用扫描电子显微镜对破骨细胞骨吸收能力进行观察,并采用Ac-YVAD-cmk、胰岛素和LXA 4处理及基因沉默NLRP3解析胞葬作用与炎症的发生与骨吸收之间的关系。结果显示,高糖能够显着抑制破骨细胞胞葬作用的发生和LXA 4的分泌以及MertK蛋白的表达,而Ac-YVAD-cmk处理能够显着逆转高糖的上述抑制作用;高糖能够诱导破骨细胞骨吸收能力的增强,而Ac-YVAD-cmk、胰岛素和LXA 4处理、基因沉默NLRP3却能够显着抑制该增强。综上所述,高糖通过激活破骨细胞NLRP3炎性小体介导的炎症及抑制胞葬作用共同增强破骨细胞骨吸收。再次,我们通过链脲佐菌素（STZ）诱导建立了糖尿病性骨质疏松大鼠模型,在体内验证了破骨细胞炎症反应以及胞葬作用被抑制是糖尿病性骨质疏松发生的机制,并且在国内外率先发现胞葬作用增强剂LXA 4能够作为治疗糖尿病性骨质疏松的潜在药物。利用ELISA对建模鼠检测破骨细胞及骨组织标记物;采用双能X射线吸收仪探查骨密度和骨矿盐;应用HE染色考查骨小梁等骨微结构完整性;借助TRAP染色测定骨组织中破骨细胞含量;通过激光共聚焦显微镜对骨组织中Cathepsin K、p-ERK、NF-κB、NLRP3以及MertK进行共定位;使用Western blot以及ELISA分析骨组织炎症相关通路蛋白p-ERK、p-p38、p-JNK、核NF-κB、p-IκB、IKK、ASC、Caspase-1、IL-18、IL-1β、NLRP3和MertK蛋白以及炎症细胞因子IL-18、IL-1β和TNF-α表达情况。结果表明,STZ建模组鼠血清中TRACP-5b、Cathepsin K以及尿液中脱氧吡啶啉的含量显着增加,而胰岛素和骨钙素的含量显着降低,且组织中骨密度和骨矿盐的含量也显着降低;病理组织切片显示,STZ建模组骨组织中各个骨小梁之间更为离散,数目减少并排列不整齐,且破骨细胞的含量显着增多;STZ建模组组织中破骨细胞能够与炎症通路相关蛋白以及MertK蛋白进行共定位;各炎症通路相关蛋白表达量以及炎性细胞因子的分泌量显着增加,但MertK表达显着降低,而LXA4和胰岛素处理均逆转了上述现象。综上所述,破骨细胞NLRP3炎症通路激活以及胞葬作用被抑制介导了大鼠糖尿病性骨质疏松发生。最后,我们针对人和犬糖尿病性骨质疏松临床病例样本,更进一步验证了在体内破骨细胞炎症反应以及胞葬作用被抑制是糖尿病性骨质疏松发生的机制。我们用与上述STZ诱导糖尿病性骨质疏松大鼠模型相同的实验方法,分别对人和犬的糖尿病性骨质疏松临床样本进行相关指标的检测和分析。结果发现,糖尿病性骨质疏松症病人和病犬体内骨组织中破骨细胞数量显着增多,且均能检测到炎症的激活以及胞葬作用的抑制。此结果与前面的体外实验结果及与STZ诱导糖尿病性骨质疏松大鼠模型的相应结果均一致。总之,本研究结果表明,高糖激活ROS/MAPKs/NF-κB/NLRP3炎症通路以及抑制胞葬作用介导破骨细胞骨吸收能力的增强是糖尿病性骨质疏松症的主要发病原因,并且发现胞葬作用增强剂LXA 4能够作为治疗糖尿病性骨质疏松的潜在药物。这些结果为更深入地探究糖尿病性骨质疏松症的发病机理以及为以后有针对性地治疗糖尿病性骨质疏松症奠定了重要的理论基础。
王智超[6]（2020）在《基于Rho A/ROCK/NF-κB信号通路探讨黄芪甲苷保护PM2.5诱导急性肺损伤的机制研究》文中认为目的:在前期实验研究“感毒清的质量控制成分黄芪甲苷对PM2.5所致急性肺损伤肺组织结构保护作用”的基础上,进一步探讨黄芪甲苷保护PM2.5所致急性肺损伤的作用机制。方法:将35只大鼠随机分成5组:空白组、模型组、黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷低剂量组、法舒地尔组。实验设计为造模前经腹腔注射（intraperitoneal injection,i.p）预防性给药,以观察药物对PM2.5造成损伤的保护性作用。预防性给药3日后开始制备急性肺损伤大鼠模型,以气道滴注PM2.5混悬液的方式进行,造模时间为预防性给药开始后的第3日、第5日。预防性给药剂量为:黄芪甲苷低剂量50mg/kg/b.w,每日给药1次;黄芪甲苷高剂量100mg/kg/b.w,每日给药1次;法舒地尔剂量10mg/kg/b.w,每日给药1次;空白组和模型组给与等体积生理盐水。本次实验于第二次造模后开始计时,计时24h时后麻醉大鼠处死,获取肺组织及肺泡灌洗液进行检测。右肺膈叶做干湿比观察肺组织水肿情况;右肺尖叶做HE染色及Mc Guigan病理评分观察病理损伤程度;副叶检测ICAM-1、IL-1β、MPO水平判断肺损伤炎症水平;BCA法检测肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白的含量,同时做细胞计数及细胞分类判断肺损伤渗出水平;部分右肺膈叶做透射电镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤情况;免疫组化法观察肺组织Rho A、ROCK1、ROCK2定位、Western Blot法检测肺组织Rho A、ROCK1、ROCK2、NF-κB、p-NF-κB、IκB、p-IκB、E-cadherin含量。实验结果采用SPSS 22.0统计软件进行数据统计及分析,Graph Pad Prism 8.0进行绘图。结果:（1）肺组织水肿情况:与空白组相比,模型组大鼠的干湿比、总肺含水量明显升高（P<0.001）;与模型组相比,各给药组大鼠肺组织干湿比、总肺含水量明显降低（P<0.001）。（2）肺组织中总蛋白含量和细胞渗出情况:在BCA法检测总蛋白渗出中,与空白组相比,模型组大鼠肺泡灌洗液中总蛋白质含量明显升高（P<0.001）;与模型组相比,各给药组大鼠肺泡灌洗液中总蛋白质含量明显降低（P<0.001）。在细胞计数和中性粒细胞瑞氏-吉姆萨染色中,与空白组相比,模型组大鼠肺泡灌洗液中细胞计数、中性粒细胞占比明显升高（P<0.001）;与模型组相比,黄芪甲苷高剂量组和法舒地尔组大鼠肺泡灌洗液中细胞计数、中性粒细胞占比明显下降（P<0.001）,黄芪甲苷低剂量组大鼠肺泡灌洗液中细胞计数有所下降（P<0.01）。（3）肺组织形态学观察:HE染色结果表明空白组大鼠肺组织结构基本完整;模型组大鼠肺泡结构出现塌陷,肺泡充血、出血明显,大量含蛋白质水液渗出,中性粒细胞和成纤维细胞聚集;各给药组大鼠肺组织结构较模型组明显好转。在病理评分中,与空白组相比,模型组大鼠病理总积分明显升高（P<0.001）,在出血（P<0.01）、肺泡充血（P<0.05）、肺泡壁增厚或透明膜（P<0.05）评分中有升高;与模型组相比,黄芪甲苷高剂量明显降低病理总积分（P<0.001）和出血评分（P<0.01）;黄芪甲苷低剂量、法舒地尔可以降低病理总积分（P<0.01）。（4）肺组织中炎症水平:与空白组相比,模型组大鼠IL-1β水平（P<0.01）、MPO活性（P<0.001）、ICAM-1活性（P<0.001）明显升高;与模型组相比,各给药组IL-1β、ICAM-1水平明显降低（P<0.001）,黄芪甲苷高剂量组、低剂量组MPO活性明显降低（P<0.001）,法舒地尔组MPO活性有所降低（P<0.01）。（5）肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构:空白组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体体积正常,肺泡结构基本正常。模型组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体体积增大且不规则,排空明显呈空泡化,肺泡结构紊乱。各给药组肺泡Ⅱ型上皮细胞结构较模型组明显好转,肺泡结构基本正常。（6）Rho A/ROCK蛋白表达:与空白组相比,模型组大鼠肺组织中Rho A/ROCK1蛋白活性明显升高（P<0.001）,ROCK2蛋白活性有一定升高（P<0.05）,E-cadherin蛋白活性明显降低（P<0.001）。与模型组相比,各给药组Rho A/ROCK1蛋白活性明显升高（P<0.001）,法舒地尔明显抑制ROCK2蛋白活性（P<0.001）,黄芪甲苷高剂量可抑制ROCK2蛋白活性（P<0.05）;黄芪甲苷高剂量组E-cadherin蛋白活性有所升高（P<0.05）,黄芪甲苷低剂量组、法舒地尔组E-cadherin蛋白活性明显升高（P<0.01）。（7）NF-κB蛋白表达:与空白组相比,模型组大鼠肺组织中p-IκB/IκB、p-NF-κB/NF-κB比值明显升高（P<0.001）;与模型组相比,各给药组大鼠肺组织中p-IκB/IκB、p-NF-κB/NF-κB比值明显降低（P<0.001）。结论:（1）黄芪甲苷可以保护PM2.5诱导的急性肺损伤,抑制PM2.5造成的炎症因子、水肿液和蛋白质渗出。（2）黄芪甲苷可以抑制PM2.5所致的炎症反应,保护肺组织的正常结构和功能。（3）黄芪甲苷对肺组织结构的保护作用可能是通过Rho A/ROCK/NF-κB信号通路发挥作用。
余世田[7]（2020）在《芹菜素抗LPS诱导的MAC-T细胞炎性反应及其分子通路》文中研究说明奶牛乳腺炎对奶牛健康造成了严重的危害,这使得治疗乳腺炎的成本不断增加。乳腺炎症是乳腺抵御外来刺激因素的免疫反应,适当的乳腺发炎对保持乳腺健康和功能的完整性具有重要意义。但当某些刺激持续作用于奶牛乳腺时,则可能引起长期的慢性炎症,造成免疫系统持续和不受控的激活,这种慢性炎症会造成奶牛个体利用率降低以及产品品质下降。核因子κB即NF-κB是一条经典的调控炎症的信号通路,其中p65亚基及调节因子对于乳腺炎的发生具有重要的调控作用。当刺激信号如细菌脂多糖LPS通过TLR4受体传入细胞内之后,经过一系列信号传递,IKK蛋白被激活进而使得IκB被磷酸化和泛素化并降解,释放出p65亚基;p65亚基发生磷酸化、乙酰化,并进入细胞核启动炎症因子,趋化因子,促炎因子的转录过程,因此IKK,IκB和p65是NF-κB信号通路的关键调控靶标,调控NF-κB及其调节蛋白对炎症预防与治疗具有重要指导意义。此外,MAPK信号通路能通过调节iNOS、COX-2等的表达参与炎症反应中的氧化应激。MAPK信号包含三个MAP激酶,即ERK1/2、JNK1/2和p38,它们存在于所有的真核细胞中。这些激酶被磷酸化后会激活iNOS、COX-2等及相关炎症因子,对ERK1/2、JNK1/2和p38磷酸化的调节可以影响炎症反应与氧化应激过程。本研究采用牛乳腺上皮细胞系MAC-T,通过MTT实验检测不同浓度芹菜素对MAC-T细胞的毒性作用,确定芹菜素作用的最佳浓度;通过不同浓度LPS进行不同时间处理筛选LPS最适的处理浓度和时间;在LPS和芹菜素不同浓度组合处理下,荧光定量检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和炎性介导因子COX-2和iNOS的相对表达量,揭示芹菜素对LPS诱导的MAC-T细胞炎症的抑制作用;通过WB检测p65、IκBα、ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化水平和免疫荧光检测IκBα的相对荧光强度以及p65的核转移变化,进一步揭示芹菜素抑制LPS诱导的MAC-T细胞炎性反应的分子通路。主要结果如下:1.LPS是一种革兰氏阴性菌细胞壁成分,能够触发炎症反应,是一种常见的炎症造模物质。通过荧光定量检测发现,不同浓度LPS（0、1、5、10、20μg/mL）和不同时间（1、12、24 h）处理后,IL-6和IL-1β的相对表达量随LPS浓度和处理时间的增加而增加;2.MTT检测发现,芹菜素的细胞毒性随其处理浓度（1、3、5、7、10、15、20、50、100μg/mL）增加而增加,当浓度达到20μg/mL时出现显着抑制细胞生长。3.不同浓度芹菜素对LPS（1μg/m L）诱导的MAC-T细胞处理24 h后结果显示,与对照组相比,芹菜素（1、7、15μg/mL）显着降低了COX-2、iNOS、IL-1β、IL-6的mRNA表达（p<0.01）;4.蛋白质印迹和免疫荧光结果表明芹菜素（1、7、15μg/mL）显着降低了MACT细胞炎症反应中p65和IκBα的磷酸化水平（p<0.05）,并且抑制了p65的核转移。另外,在MAC-T细胞炎症反应中,p38、JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平在芹菜素处理后也显着降低（p<0.01）。结论:1.芹菜素在<20μg/mL条件下,具有较低的细胞毒性;2.LPS能在较低浓度（1μg/m L）下处理1 h就能引起MAC-T细胞中炎症因子IL-6的极显着上调;3.芹菜素通过下调MAC-T炎症细胞中COX-2、iNOS、IL-1β、IL-6的表达量发挥抗炎作用;4.芹菜素的抗炎和抗氧化活性是通过抑制NF-κB和MAPK信号通路。这些结果提示,芹菜素可用于预防和治疗奶牛乳腺炎。
章维志[8]（2020）在《基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路研究地奥心血康抗大鼠动脉粥样硬化作用》文中提出目的观察地奥心血康对动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）大鼠TLR4/My D88/NF-κB信号通路的影响,探讨其抗AS的作用机制。方法选取雄性SD大鼠,适应性饲养1周后随机分为正常对照组,模型组,阿托伐他汀组(2.0 mg·kg-1),地奥心血康高剂量组(100 mg·kg-1)、中剂量组(30 mg·kg-1)、低剂量组(10 mg·kg-1),每组10只。正常组喂食普通饲料,其余各组给予高脂饲料并在实验开始时一次性腹腔注射维生素D2（Vitamin D2,VD2）6.0×105IU·kg-1,实验第3,6,9周再分别注射VD21.0×105IU·kg-1。第10周起灌胃给药,连续8周。观察大鼠一般状态;检测血清总胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol,HDL-C）水平;计算大鼠心脏系数和AS指数（Atherosclerosis index,AI）;酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测血清肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）,白介素-6（Interleukin-6,IL-6）,白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）水平;苏丹IV染色法观察主动脉AS斑块病变程度及分布范围;苏木精伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）观察主动脉病理形态的改变;Masson染色法观察主动脉窦部的胶原纤维表达含量;实时荧光定量聚合酶链反应（Real time quantitative-polymerase chain reaction,RT-q PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot,WB）法检测主动脉组织TLR4,My D88,NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达。结果1.大鼠一般状态:正常对照组大鼠皮毛光泽,精神良好,饮食、尿量、体重增加平稳。模型组大鼠皮毛光泽暗淡,颜色枯黄,日常活动明显减少,精神萎靡,困倦嗜睡,饮食和饮水量减少,体重明显减轻;给药组大鼠皮毛逐渐恢复光泽,体重有不同程度的增加,情况有所改善。2.地奥心血康对大鼠血脂水平的影响:与正常对照组比较,模型组血清TC,TG,LDL-C水平显着升高（P<0.01）,HDL-C水平显着下降（P<0.05）;与模型组比较,地奥心血康高、中剂量组和阿托伐他汀组血清TC,TG,LDL-C含量显着降低（P<0.05或P<0.01）,HDL-C含量显着升高（P<0.01）。3.地奥心血康对大鼠心脏系数和AI的影响:与正常组比较,模型组大鼠心脏系数和AI显着高于正常组（P<0.01）;与模型组比较,地奥心血康各剂量组和阿托伐他汀组均不同程度降低心脏系数和AI（P<0.05,P<0.01）。4.地奥心血康对大鼠主动脉病变的影响:苏丹IV染色,正常对照组大鼠主动脉内膜比较光滑、干净;模型组主动脉内膜含有数量不一的红色斑块（脂滴）,斑块面积与主动脉内膜总面积比值显着增加（P<0.01）;与模型组比较,地奥心血康各剂量组和阿托伐他汀组主动脉内膜的斑块大小及数量相对减少,斑块面积与主动脉内膜总面积比值明显下降（P<0.05或P<0.01）。主动脉HE染色,正常对照组大鼠主动脉形态正常,血管内皮连续完整光滑,血管平滑肌细胞排列规则整齐;模型组大鼠主动脉内膜增厚,内皮不连续,平滑肌细胞明显增殖、排列紊乱,大量泡沫细胞聚集;地奥心血康各剂量组和阿托伐他汀组主动脉病理改变明显减轻。主动脉窦Masson染色,模型组大鼠主动脉窦部胶原纤维含量明显增加,胶原纤维面积与动脉管腔总面积的比值明显升高（P<0.01）;与模型组相比,地奥心血康各剂量组和阿托伐他汀组胶原纤维含量不同程度减少,胶原纤维面积与动脉管腔总面积的比值下降（P<0.05或P<0.01）。5.地奥心血康对大鼠血清TNF-α,IL-1β,IL-6水平的影响:与正常对照组比较,模型组血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平显着升高（P<0.01）;与模型组比较,地奥心血康中、高剂量组和阿托伐他汀组TNF-α,IL-1β,IL-6含量显着降低（P<0.01）,地奥心血康低剂量组TNF-α含量降低（P<0.01）。6.地奥心血康对大鼠主动脉TLR4,My D88,NF-κBp65 mRNA和蛋白表达的影响:与正常对照组比较,模型组大鼠主动脉TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较,地奥心血康各剂量组和阿伐他汀组大鼠主动脉TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA基因表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。与正常对照组比较,模型组大鼠主动脉TLR4、My D88、NF-κB p65蛋白表达水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较,地奥心血康各剂量组和阿伐他汀组大鼠主动脉TLR4、My D88、NF-κB p65蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。结论地奥心血康对大鼠动脉粥样硬化具有防治作用,其作用机制之一可能是通过调控TLR4/My D88/NF-κB信号转导,减轻炎症反应,抑制动脉粥样硬化进程。
樊华[9]（2019）在《补肾中药沙苑子总黄酮对斑马鱼及RAW264.7巨噬细胞模型抗炎作用机制的研究》文中研究指明背景:心血管疾病是全球引起死亡最常见的原因之一,炎症则机体常见的生理和病理反应,两者相关的概念已经快速地进入到临床或研究之中。诸多心血管疾病都伴有炎症反应的发生,而在这些炎症反应中,单核-巨噬细胞作为重要的炎症细胞广泛参与其中,释放出多种炎症介质进而引起相应炎症通路激活,参与心血管疾病的发生发展。沙苑子是临床常用的补肾中药,其主要有效成分黄酮类（沙苑子总黄酮）对具有降压、降脂、抗氧化、抗炎等多种药理作用。但对沙苑子总黄酮抗炎作用和机制研究尚未见深入报道。目的:应用体内转基因斑马鱼急性炎症损伤模型,体外LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症反应模型,探究沙苑子主要有效成分沙苑子总黄酮对炎症反应的抑制作用及其机理,为疗效确切、安全性高的中药研究提供新的思路。方法:提取沙苑子总黄酮,使用HPLC法检测沙苑子总黄酮成分并进行质控分析;构建Tg（Cora1a:EGFP/Lyz:Ds RED）斑马鱼急性炎症损伤模型,通过斑马鱼毒性实验,确定沙苑子总黄酮对斑马鱼实验的安全浓度范围。加入沙苑子总黄酮进行干预治疗,通过观察荧光标记的巨噬细胞及中性粒细胞的迁移情况,微量法检测斑马鱼体内NO的产生情况,以及RT-PCR法检测炎症因子i NOS、TNF-α、IL-1β、IL-10等基因变化,来观察沙苑子总黄酮对Tg（Cora1a:EGFP/Lyz:Ds RED）斑马鱼急性炎症损伤的炎症抑制作用;构建LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型,加入沙苑子总黄酮进行干预后,通过CCK-8检测细胞活性,Griess试剂检测NO的生成,TNF-α试剂盒检测TNF-α的生成,RT-PCR检测i NOS基因表达变化,并通过Western Blot检测i NOS、NF-κB、I-κB、P38、JNK、ERK1/2的蛋白表达,以及加入NF-κB抑制剂PDTC、P38抑制剂SB203580和ERK1/2抑制剂PD98059后,NF-κB、P38、ERK1/2各自的蛋白表达情况,来探讨沙苑子总黄酮在抗炎症反应中的信号通路及分子机制。结果:沙苑子总黄酮的主要成分为沙苑子苷A和沙苑子苷B;Tg（Cora1a:EGFP/Lyz:Ds RED）斑马鱼急性炎症损伤模型中,沙苑子总黄酮在15-30μg/m L浓度范围内对斑马鱼无毒性作用,且可显着抑制急性炎症损伤后巨噬细胞及中性粒细胞的聚集迁移、NO的生成量以及i NOS炎症基因的表达,但对促炎因子TNF-α、IL-1β及抑炎因子IL-10的表达无影响;LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型中,沙苑子总黄酮在12.5-400μg/m L浓度范围内对巨噬细胞无毒性作用,可显着抑制炎症反应中NO、i NOS的生成,而对TNF-α无作用,Western Blot实验结果显示沙苑子总黄酮显着抑制NF-κB及I-κB的表达,并且这种抑制可被PDTC阻断,而对P38、JNK、ERK1/2的蛋白表达无明显作用。结论:沙苑子总黄酮对斑马鱼急性炎症反应及LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应具有炎症抑制作用,其机制可能与沙苑子总黄酮对NO生成的调控作用及抑制NF-κB/i NOS信号通路有关。
李红玲,谭麒麟[10]（2016）在《核因子-κB与动脉粥样硬化》文中研究指明核因子（NF）-κB是属于Rel家族的转录因子,是与诸多包括动脉粥样硬化（AS）在内炎症性疾病密切相关的细胞内信号转导通路。在AS发展的各个阶段,从斑块形成到稳定和破裂,活化的NF-κB通过调节下游如细胞因子、炎症介质、趋化因子等参与AS的信号转导。1 NF-κB通路的组成1.1 NF-κB家族转录因子NF-κB是1986年首次在成熟的B淋巴细胞核提取时发现的,能与免疫球蛋白kappa（k）轻链上的
二、Rel/NF-κB/IκB/IKK信号转导途径与动脉粥样硬化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Rel/NF-κB/IκB/IKK信号转导途径与动脉粥样硬化（论文提纲范文）
（1）ICA通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 淫羊藿苷的药理学作用 |
| 1.1.1 对心血管系统的作用 |
| 1.1.2 对免疫调节的作用 |
| 1.1.3 抗肿瘤的作用 |
| 1.1.4 对骨代谢的作用 |
| 1.1.5 对神经系统的作用 |
| 1.1.6 对生殖系统的作用 |
| 1.2 miRNAs与动脉粥样硬化 |
| 1.2.1 miRNAs对内皮细胞的影响 |
| 1.2.2 miRNAs对平滑肌细胞的影响 |
| 1.2.3 miRNAs对巨噬细胞的影响 |
| 1.3 常见信号通路与动脉粥样硬化的关系研究 |
| 1.3.1 NF-κB信号通路 |
| 1.3.2 MAPK信号通路 |
| 1.3.3 Toll样受体通路 |
| 1.3.4 Janus激酶/信号转导及转录激活因子信号通路 |
| 1.3.5 PI3K/AKT信号通路 |
| 第2章 ICA抗AS miRNAs芯片生物信息学分析及miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 药品及试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 差异miRNAs的筛选 |
| 2.2.3 差异miRNAs在RAW264.7中表达的验证及目的miRNA的确定 |
| 2.2.4 miR-672-5p的靶基因预测以及GO分析 |
| 2.2.5 KEGG通路分析、靶基因确定及信号通路构建 |
| 2.2.6 ApoE~(-/-)小鼠胸主动脉组织中miR-672-5p、AKT3 mRNA及蛋白的表达 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 差异miRNAs的筛选 |
| 2.3.2 差异miRNAs在RAW264.7中表达的验证及目的miRNA的确定 |
| 2.3.3 miR-672-5p靶基因预测和功能富集结果 |
| 2.3.4 miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路构建 |
| 2.3.5 miR-672-5p、AKT3基因及蛋白在ApoE-/-小鼠胸主动脉组织中的表达 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 ICA对ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应的作用及机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 药品及试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 CCK-8检测RAW264.7细胞的增殖情况 |
| 3.2.3 油红O染色检测RAW264.7泡沫化的形成 |
| 3.2.4 ELISA检测RAW264.7培养上清IL-1β IL-6及TNF-α的含量 |
| 3.2.5 qPCR检测RAW264.7中miR-672-5p及AKT3 mRNA的表达 |
| 3.2.6 Western Blot检测RAW264.7中AKT3及相关信号通路蛋白的表达情况 |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 ox-LDL诱导巨噬细胞源性泡沫细胞模型最佳浓度、时间确定 |
| 3.3.2 ICA对ox-LDL诱导RAW264.7细胞活力影响的浓度确定 |
| 3.3.3 ICA对ox-LDL诱导RAW264.7泡沫化的影响 |
| 3.3.4 ICA对ox-LDL诱导RAW264.7培养上清IL-1β、IL-6及TNF-α含量的影响 |
| 3.3.5 ICA对ox-LDL诱导RAW264.7 miR-672-5p及AKTmRNA表达的影响 |
| 3.3.6 ICA对ox-LDL诱导RAW264.7中AKT3以及信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 miR-672-5p在ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应中的作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 药品及试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 miR-672-5p对AKT3靶向调控作用的验证 |
| 4.2.2 miR-672-5p对ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应的影响 |
| 4.2.3 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 miR-672-5p与AKT3靶向调控的验证 |
| 4.3.2 miR-672-5p对ox-LDL诱导RAW264.7炎症反应的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 ICA治疗ApoE~(-/-)小鼠AS的miRNA芯片的生物信息学分析及miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路的构建 |
| 5.2 巨噬细胞源性泡沫细胞的构建 |
| 5.3 ICA改善ox-LDL诱导RAW264.7的炎症反应 |
| 5.3.1 ICA抑制ox-LDL诱导RAW264.7的泡沫化 |
| 5.3.2 ICA减少ox-LDL诱导RAW264.7培养上清IL-1β、IL-6及TNF-α的含量 |
| 5.4 ICA通过miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应 |
| 5.4.1 miR-672-5p/AKT3的生物学作用 |
| 5.4.2 ICA通过miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应 |
| 5.5 miR-672-5p作为ICA抑制RAW264.7炎症反应作用靶点的探讨 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）靶向干预NF-κB通路对压力超负荷性心肌重塑的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 病毒信息 |
| 1.3 主要试剂和设备 |
| 1.4 重要试剂的配置 |
| 2 实验内容与方法 |
| 2.1 研究对象的分组 |
| 2.2 H9C2 心肌细胞的培养 |
| 2.3 MTT检测AngⅡ对H9C2 心肌细胞活力的影响 |
| 2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.5 动物模型的建立 |
| 2.6 动物的血流动力学检测 |
| 2.7 qRT-PCR检测 |
| 2.8 病理学检测 |
| 2.9 ELISA法检测动物血清TNF-α、IL-6 |
| 2.10 Western blot检测蛋白表达 |
| 3 质量控制 |
| 3.1 实验设计 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 动物模型的建立 |
| 3.4 Western blot |
| 4 统计分析 |
| 5 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 Nf-κB 与心室重构 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（3）巨噬细胞来源CXCL12在动脉粥样硬化中的作用及相关分子机制的研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ ox-LDL诱导巨噬细胞分泌CXCL12对动脉粥样硬化影响及细胞机制的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 动脉粥样硬化中巨噬细胞分泌CXCL12及促进血管平滑肌细胞增殖和泡沫化分子机制的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 课题的创新点及局限性 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文 |
（4）Ox-LDL复合物通过NF-κB介导的炎症信号通路对血管内皮细胞损伤机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 综述 |
| 1.2.1 动脉粥样硬化病理过程 |
| 1.2.2 Ox-LDL复合物与AS |
| 1.2.3 ET-1、IL-1β、TNF-α与AS |
| 1.2.4 锌与AS |
| 1.2.5 动脉粥样硬化常见信号通路 |
| 第2章 Ox-LDL复合物通过TRAF3IP2/IKKγ/NF-κB信号通路对血管内皮细胞损伤机制研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 锌通过PPARγ/NF-κB信号通路对Ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤的保护机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 结论及创新点 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 导师及作者简介和研究生期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）破骨细胞炎症通路激活和胞葬作用抑制介导糖尿病性骨质疏松的发病机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 糖尿病性骨质疏松的研究进展 |
| 1.1 糖尿病性骨质疏松的研究背景 |
| 1.2 糖尿病性骨质疏松的流行病学 |
| 1.3 糖尿病性骨质疏松发病机制的研究现状 |
| 1.4 糖尿病性骨质疏松的治疗 |
| 第二章 炎症的研究进展 |
| 2.1 炎症的概述 |
| 2.2 ROS |
| 2.3 炎症相关通路 |
| 第三章 胞葬作用的研究进展 |
| 3.1 胞葬作用的概述 |
| 3.2 胞葬作用的特征 |
| 3.3 胞葬作用的信号 |
| 3.4 胞葬作用与炎症之间的关系 |
| 3.5 胞葬作用参与疾病 |
| 第四章 破骨细胞与骨质疏松症的研究进展 |
| 4.1 破骨细胞概述 |
| 4.2 破骨细胞与骨质疏松症的关系 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 高糖诱导破骨细胞ROS产生并激活MAPKs/NF-κB/NLRP3炎症通路 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 高糖激活NLRP3炎性小体介导的炎症与其对破骨细胞胞葬抑制作用共同增强破骨细胞骨吸收 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 破骨细胞NLRP3炎症通路激活和胞葬作用抑制介导大鼠糖尿病性骨质疏松发生 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 糖尿病性骨质疏松症发生机制的人与犬临床确证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）基于Rho A/ROCK/NF-κB信号通路探讨黄芪甲苷保护PM2.5诱导急性肺损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写 |
| 第一部分 文献回顾 |
| 1.颗粒物污染与健康效应 |
| 1.1.细颗粒物PM2.5的理化特征 |
| 1.2.细颗粒物PM2.5对健康效应的影响 |
| 1.3.细颗粒物PM2.5对呼吸系统的影响机制 |
| 2.细颗粒物诱导急性肺损伤的机制探讨 |
| 2.1.急性肺损伤与细颗粒物 |
| 2.2.炎症损伤是细颗粒物致急性肺损伤的重要机制 |
| 2.3.肺泡上皮细胞介导的水液转运功能下降是细颗粒物致肺损伤的关键结局 |
| 2.4.肺微血管内皮细胞介导的炎症渗出是细颗粒物致肺损伤的中心环节 |
| 2.5.粘附分子在细颗粒物致急性肺损伤中的桥梁作用 |
| 3.Rho A/ROCK信号通路在细颗粒物致急性肺损伤中的作用探讨 |
| 3.1.小G蛋白Ras超家族中相关蛋白的基本生物学特征 |
| 3.2.Rho A/ROCK信号通路在炎症因子介导急性肺损伤中的作用机制 |
| 4.NF-κB信号通路在细颗粒物致急性肺损伤中的作用探讨 |
| 4.1.NF-κB信号通路中相关蛋白的基本生物学特征 |
| 4.2.NF-κB信号通路在炎症因子介导急性肺损伤中的直接作用 |
| 5.细颗粒物PM2.5介导急性肺损伤的中医认识 |
| 5.1.中医学对PM2.5为主的大气污染的认识 |
| 5.2.PM2.5所致肺系疾病及急性肺损伤的中医认识 |
| 5.3.中药黄芪的益气功效是预防环境毒邪致病的关键 |
| 6.参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1.本课题的研究思路,内容 |
| 1.1.研究思路 |
| 1.2.研究内容 |
| 1.3.技术路线图 |
| 2.实验材料 |
| 2.1.实验动物 |
| 2.2.动物饲养 |
| 2.3.主要试验仪器和设备 |
| 2.4.实验材料和试剂 |
| 3.试验方法 |
| 3.1.动物分组 |
| 3.2.给药方法 |
| 3.3.造模方法 |
| 3.4.动物处死 |
| 3.5.实验流程图 |
| 3.6.标本获取 |
| 3.7.指标检测 |
| 3.8.统计学方法及绘图 |
| 4.实验结果 |
| 4.1.一般情况 |
| 4.2.肺组织形态学观察 |
| 4.3.肺水肿指标的变化趋势 |
| 4.4.BALF中总蛋白含量的测定 |
| 4.5.肺组织HE染色 |
| 4.6.肺组织Mc Gugan病理评分 |
| 4.7.肺泡灌洗液(BALF)中的细胞计数 |
| 4.8.肺组织中炎症因子水平的测定 |
| 4.9.肺组织中MPO水平的测定 |
| 4.10.肺组织中黏附因子的测定 |
| 4.11.肺组织超微结构的透射电镜分析 |
| 4.12.肺组织中相关蛋白的Western Blot检测 |
| 4.13.肺组织中相关蛋白的免疫组化分析 |
| 4.14.E-cadherin、ICAM-1与ALI相关指标的相关性分析 |
| 4.15.E-cadherin、ICAM-1与ALI相关指标的回归性分析 |
| 4.16.小结 |
| 5.讨论 |
| 5.1.PM2.5诱导急性肺损伤大鼠模型的构建 |
| 5.2.基于多步骤黏附理论探讨炎症损伤在PM2.5致ALI中的作用机制 |
| 5.3.黄芪甲苷对PM2.5诱导急性肺损伤大鼠肺组织结构的保护作用 |
| 5.4.基于Rho A/ROCK/NF-κB通路探讨黄芪甲苷保护肺组织结构、抑制炎症渗出的机制 |
| 结论 |
| 本实验创新性及意义 |
| 存在问题及展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 中药黄芪补气功效与药理作用的研究进展 |
| 1.中药黄芪 |
| 1.1.历史沿革 |
| 1.2.化学成分 |
| 2.黄芪补气之功 |
| 2.1.益气升阳 |
| 2.2.益气止咳喘 |
| 2.3.益卫固表 |
| 2.4.补气利水 |
| 3.药理学作用 |
| 3.1.炎症损伤的药理学机制 |
| 3.2.免疫调节的药理学机制 |
| 4.黄芪及其化合物在急性肺损伤中的运用 |
| 5.总结 |
| 6.参考文献 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（7）芹菜素抗LPS诱导的MAC-T细胞炎性反应及其分子通路（论文提纲范文）
| 英文缩略词一览表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 奶牛乳腺炎的致病因素 |
| 1.1.1 微生物因素 |
| 1.1.2 物理因素 |
| 1.2 乳腺上皮细胞炎性反应信号通路 |
| 1.2.1 NF-κB通路 |
| 1.2.2 NF-κB与乳腺炎发生的相关性研究 |
| 1.2.3 MAPK信号通路 |
| 1.3 植物提取物的抗炎作用 |
| 1.4 芹菜素抗炎作用研究进展 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究目的及意义 |
| 2.2 技术路线 |
| 第3章 实验材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 MAC-T细胞培养 |
| 3.1.2 主要实验试剂及实验耗材 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 芹菜素对MAC-T的毒性 |
| 3.2.2 MAC-T细胞炎症模型建立 |
| 3.2.3 芹菜素抑制MAC-T炎症反应中炎症相关因子的表达 |
| 3.2.4 芹菜素抑制MAC-T炎症反应中NF-κB信号通路的激活 |
| 3.3 统计分析 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 芹菜素对MAC-T细胞的毒性 |
| 4.2 炎症模型的建立 |
| 4.3 芹菜素对MAC-T细胞炎症相关因子m RNA表达的影响 |
| 4.4 芹菜素对NF-κB信号通路的影响 |
| 4.4.1 芹菜素对p65和IκBα磷酸化的影响 |
| 4.4.2 芹菜素对NF-κB核转移的影响 |
| 4.5 芹菜素对MAPK信号通路的影响 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路研究地奥心血康抗大鼠动脉粥样硬化作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表(Abreviation) |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组与给药 |
| 2.2 大鼠一般状态观察 |
| 2.3 标本的采集 |
| 2.4 血清TC,TG,LDL-C,HDL-C测定 |
| 2.5 心脏系数和动脉粥样硬化指数的测定 |
| 2.6 主动脉大体苏丹IV染色 |
| 2.7 主动脉HE染色 |
| 2.8 主动脉窦Masson染色 |
| 2.9 ELISA法检测血清TNF-α,IL-6,IL-1β水平 |
| 2.10 RT-q PCR法检测主动脉TLR4,My D88,NF-κB mRNA表达 |
| 2.11 Western blot法检测主动脉TLR4,My D88,NF-κB的蛋白表达 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 地奥心血康对大鼠一般状态的影响 |
| 3.2 地奥心血康对大鼠血脂水平的影响 |
| 3.3 地奥心血康对大鼠心脏系数和动脉粥样硬化指数的影响 |
| 3.4 地奥心血康对大鼠主动脉斑块的影响 |
| 3.5 地奥心血康对大鼠主动脉病理变化的影响 |
| 3.6 地奥心血康对大鼠主动脉窦部胶原纤维含量的影响 |
| 3.7 地奥心血康对大鼠血清IL-1β,IL-6,TNF-α水平的影响 |
| 3.8 地奥心血康对大鼠主动脉 TLR4,My D88,NF-κBp65 m RNA 表达的影响 |
| 3.9 地奥心血康对大鼠主动脉TLR4,My D88,NF-κBp65 蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 大鼠动脉粥样硬化模型的选择及评价 |
| 4.2 动脉粥样硬化与炎症的关系 |
| 4.3 阳性药物的选择 |
| 4.4 地奥心血康抗AS的作用机制 |
| 5 结论 |
| 6 创新点与展望 |
| 6.1 创新点 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 动脉粥样硬化与 TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）补肾中药沙苑子总黄酮对斑马鱼及RAW264.7巨噬细胞模型抗炎作用机制的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 心血管疾病与巨噬细胞 |
| 2 补肾药沙苑子与心血管疾病 |
| 3 斑马鱼模型 |
| 4 巨噬细胞模型 |
| 第一部分 沙苑子总黄酮的提取、分离及结构分析 |
| 1 仪器与材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 沙苑子总黄酮对急性损伤诱导的斑马鱼炎症模型的抑炎作用机制研究 |
| 一、沙苑子总黄酮对斑马鱼毒性作用 |
| 1 材料与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 二、沙苑子总黄酮对斑马鱼巨噬细胞与炎症因子的作用 |
| 1 材料与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 第三部分 沙苑子总黄酮对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型的抑炎作用机制研究 |
| 一、沙苑子总黄酮对RAW264.7巨噬细胞的保护作用 |
| 1 材料与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 二、沙苑子总黄酮对LPS诱导RAW264.7 巨噬细胞炎症损伤MAPK和NF-κB信号通路的影响 |
| 1 材料与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3.统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5.讨论 |
| 全文讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附录一:沙苑子化合物 1 氢谱碳谱质谱图 |
| 附录二:沙苑子化合物 2 氢谱碳谱质谱图 |
| 附录三:文献综述 巨噬细胞对心脏重塑的作用 |
| 参考文献 |
| 附录四:硕士期间已发表的论文全文 |
（10）核因子-κB与动脉粥样硬化（论文提纲范文）
| 1 NF-κB通路的组成 |
| 1.1 NF-κB家族 |
| 1.2 IκB家族 |
| 1.3 IκB激酶(IKK)复合物 |
| 1.4 NF-κB信号通路的激活 |
| 1.4.1经典通路 |
| 1.4.2旁路通路 |
| 1.5 NF-κB通路的靶基因 |
| 2 NF-κB与疾病 |
| 2.1 NF-κB与炎症 |
| 2.2 NF-κB与血管生成 |
| 2.3 NF-κB与凋亡 |
| 2.4 NF-κB与急性冠脉综合征 |
| 2.5 NF-κB与血栓形成 |
| 3 AS |
| 4 NF-κB与AS |
| 4.1 AS的起始阶段 |
| 4.2 AS进展期 |
| 4.3 动脉斑块的破裂 |
四、Rel/NF-κB/IκB/IKK信号转导途径与动脉粥样硬化（论文参考文献）
- [1]ICA通过调控miR-672-5p/AKT3/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的RAW264.7炎症反应[D]. 李藤藤. 吉林大学, 2021(01)
- [2]靶向干预NF-κB通路对压力超负荷性心肌重塑的作用研究[D]. 王栩越. 新疆医科大学, 2021(02)
- [3]巨噬细胞来源CXCL12在动脉粥样硬化中的作用及相关分子机制的研究[D]. 李令兴. 山东大学, 2020(08)
- [4]Ox-LDL复合物通过NF-κB介导的炎症信号通路对血管内皮细胞损伤机制研究[D]. 刘依侬. 吉林大学, 2020(08)
- [5]破骨细胞炎症通路激活和胞葬作用抑制介导糖尿病性骨质疏松的发病机制研究[D]. 安雅男. 吉林大学, 2020(08)
- [6]基于Rho A/ROCK/NF-κB信号通路探讨黄芪甲苷保护PM2.5诱导急性肺损伤的机制研究[D]. 王智超. 成都中医药大学, 2020
- [7]芹菜素抗LPS诱导的MAC-T细胞炎性反应及其分子通路[D]. 余世田. 西南大学, 2020(01)
- [8]基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路研究地奥心血康抗大鼠动脉粥样硬化作用[D]. 章维志. 安徽中医药大学, 2020(03)
- [9]补肾中药沙苑子总黄酮对斑马鱼及RAW264.7巨噬细胞模型抗炎作用机制的研究[D]. 樊华. 上海中医药大学, 2019(03)
- [10]核因子-κB与动脉粥样硬化[J]. 李红玲,谭麒麟. 中国老年学杂志, 2016(22)